巴西橡胶树MADS-box基因家族6个成员的染色体物理定位

陶志强 张宇航 王英 高和琼 庄南生

摘  要：MADS-box基因家族广泛分布于真核生物中，巴西橡胶树的MADS-box基因家族主要参与花形态建成，对生殖生长起到重要的调节作用。目前，MADS-box基因家族的26个相关基因已被克隆分析，但它们在染色体上的具体位置还未确定。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97品种为材料，将MADS-box基因家族的6个成员（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1）定位在细胞核染色体上，通过双探针荧光原位杂交技术（FISH）对巴西橡胶树MADS-box基因家族的这6个成员在细胞核染色体上进行物理定位分析。结果表明：MADS-box基因家族的6个基因分别位于不同的染色体上，其中HbAGL15、HbAG8、HbAG30和HbSVP1基因定位在第4、5、7和8号染色体长臂上，其信号位点到着丝粒的平均百分距离是11.85、39.71、48.94和6.70;HbTT16和HbAP1基因定位在第1和13号染色体短臂上，其信号位点到着丝粒的平均百分距离是22.19和18.01。本研究结果揭示了巴西橡胶树MADS-box基因家族的6个成员在细胞核染色体上的实际位置，展现家族基因之间的分布特点和连锁遗传关系，不仅丰富了橡胶树分子细胞遗传学信息，也为橡胶树的分子辅助育种和比较基因组学研究提供了分子细胞遗传学的科学理论依据。

关键词：巴西橡胶树;MADS-box基因家族;荧光原位杂交（FISH）;物理定位

中图分类号：Q23      文献标识码：A

Abstract： The MADS-box gene family is widely distributed in eukaryotes. The MADS-box gene family of Hevea brasiliensis is mainly involved in flower morphogenesis and plays an important role in regulating reproductive growth. At present， 26 related genes of the MADS-box gene family have been cloned and analyzed， but the specific positions on the chromosome have not been determined. Six members of the MADS-box gene family （HbAGL8， HbAG15， HbAGL30， HbTT16， HbAP1 and HbSVP1） of ‘Reyan 7-33-97 were localized on the nuclear chromosome. Physical localization analysis of the six genes on the nuclear chromosome was performed using dual-probe fluorescence in situ hybridization （FISH）. The results showed that the six genes were located on different chromosomes. HbAGL15， HbAG8， HbAG30 and HbSVP1 genes were located on the long arm of chromosome 4， 5， 7 and 8 with PDCS （percent distance from centromere to the signal site） 11.85， 39.71， 48.94 and 6.70， respectively. HbTT16 and HbAP1 gene were located on the short arm of chromosome 1 and 13 with PDCS 22.19 and 18.01， respectively. This study reveals the actual position of the six genes of H. brasiliensis on the nuclear chromosome， shows the distribution characteristics and linkage genetic relationship between family genes， which not only enriching molecular cytogenetics information， but also providing scientific theoretical basis for molecular assisted breeding and comparative genomics research of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; MADS-box gene family; fluorescence in situ hybridization （FISH）; physical localization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.001

MADS-box基因家族是一類序列相对保守的基因家族，它编码的蛋白具有激活或抑制目的基因转录表达的作用，广泛分布于真核生物中，最先在Minichromosome Maintenance（酵母菌代谢调节因子）[1]、Agamous（拟南芥花器官发育决定因子）[2]、Deficienns（金鱼草花器官发育决定因子）[3]和Serum Response Factor（人类血清反应因子SRF4）[4]4个基因的研究中确定其存在，因此，取各基因的首字母而命名为MADS-box基因家族。

前人对于MADS-box基因的研究最早是从拟南芥和金鱼草的花形态突变体开始的[5]，深入研究后，不仅从番茄[6]、葡萄[7]、荷花[8]、小麦[9]等植物中克隆出MADS-box基因家族相关基因，还发现MADS-box基因除了与花形态建成调控[10]有关外，还在促进根的形成[11]、分生组织的分化[12]、开花时间的调控[13]、花粉成熟[14]、种子和果实发育成熟[15-16]等众多方面发挥着重要作用，与植物的生长发育密切相关。

在橡胶树MADS-box基因家族的相关研究中，Dornelas等[17]发现HbLFY基因在产生花序的侧分生组织和所有花分生组织中均有表达，推测HbLFY与植物开花相关;华玉伟等[18]对HbFCA基因进行克隆与功能分析，推测HbFCA基因参与植物开花起始的调节;王辉等[19]克隆了MADS27基因，推测在开花过程中起调控作用;魏利然等[20]对HbMADS4基因进行克隆与功能分析，推测其作为一个负调控因子调控合成天然橡胶;王亚杰[21]克隆并功能验证了MADS-box家族的26个基因，发现该家族相关基因在茎尖、花器官显著高调表達，推测其在花形态建成和生殖发育过程中起显著作用。

本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97品种古铜期嫩叶为材料，制备染色体标本，利用荧光原位杂交技术对MADS-box基因家族中的HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1共6个基因进行染色体定位，从而揭示MADS-box基因家族分别在细胞核染色体上的实际位置，同时分析各个基因之间的分布特点，这有利于完善功能基因的分子细胞遗传学信息，为MADS-box基因功能研究提供新的理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

以橡胶树无性系‘热研7-33-97古铜期叶片稍微展开的嫩叶为材料;应在天气晴朗且光照充足的上午采摘样品。DNA提取材料为黄绿色（减少DNA提取时色素的污染）的橡胶树嫩叶（图1B）。制备染色体标本的橡胶树古铜期嫩叶（图1A）应先于饱和对二氯苯溶液中浸泡2 h，清洗至无味后，使用双蒸水低渗处理30～60 min;弃双蒸水，转入卡诺式固定液（无水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中于4 ℃冰箱内固定12～20 h;弃固定液，使用75%、90%和100%酒精各脱水5 min，最后转入70%乙醇溶液中于?20 ℃冰箱内保存备用。

1.2  方法

1.2.1  染色体标本的制备  染色体标本的制备主要参照高和琼等[22]和李懋学等[23]的方法，以巴西橡胶树‘热研7-33-97品种古铜期嫩叶为材料，取有丝分裂旺盛的叶边缘进行染色体标本制备，然后将制备好的染色体标本进行下一步荧光原位杂交（FISH）或存放于?20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2  特异性引物的设计与筛选  根据MADS- box基因家族中6个基因的登录号在NCBI上找到目的基因序列，利用NCBI上在线比对软件BLAST程序进行序列同源性比对，找到序列比对同源性最高的（98%以上）巴西橡胶树‘热研7-33-97品种全基因组序列。使用Primer Permier 5设计引物。以橡胶树基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，48～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环;72 ℃后延伸7 min。将PCR产物进行凝胶电泳检测，检验产物是否为单一条带。单一条带且长度符合的PCR产物测序后用DNAMAN软件进行多序列比对，判断是否符合引物的特异性。最后将6个对应基因PCR扩增单一目的条带产物纯化，检测其浓度，于?20 ℃保存。筛选得到特异性引物见表1。

1.2.3  探针的制备  将扩增纯化后的6个基因的特异DNA序列中HbAGL8、HbTT16和HbAP1基因用生物素切口平移（BIO-Nick Translation Mix）试剂盒标记成探针，信号位点呈红色。HbAG15、HbAGL30和HbSVP1基因用地高辛切口平移（DIG-Nick Translation Mix）试剂盒标记成探针，信号位点呈绿色。探针纯化后于?20 ℃保存待用。

1.2.4  荧光原位杂交  参照官锦燕[24]的方法，并稍作改进，操作如下：首先将染色体形态良好且分散的染色体标本于70 ℃烘箱中恒温处理2 h左右，起牢化作用，做好标记区分正面;37 ℃下使用10 mg/mL RNA酶溶液处理1 h，减少杂信号影响，使特异信号清晰;在70 ℃预热后的70%去离子甲酰胺中变性5 min后快速放入预冷的70%、90%和100%酒精各脱水5 min，用冷风吹干;滴加45 μL经变性处理后的杂交液[50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2×SSC（柠檬酸缓冲液），0.5 mg/mL鲑鱼精DNA，20 ng/μL已标记探针]在标本正面中央，盖上盖玻片并用指甲油封片后放入杂交仪中，先于90 ℃变性10 min，后于37 ℃孵育16～24 h;孵育结束后用刀片轻轻揭开盖片，依次在2×SSC溶液中洗涤10 min、20%去离子甲酰胺（42 ℃）静置10 min、2×SSC溶液中洗涤5 min，1×PBS溶液中洗涤5 min。

级联荧光信号显示与放大操作如下：首先滴加50 μL由终浓度为20 μg/mL鼠抗地高辛-Alexa Fluor488、终浓度为10 μg/mL链亲和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）和1%牛血清白蛋白（中文名称）配制成的混合液，孵育1 h;然后滴加总体积50 μL的终浓度为20 μg/mL兔抗鼠-Alexa Fluor 488[Alexa Fluor 488-Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgG （H+L）]、终浓度为10 μg/mL生物素化抗链亲和素（Biotinylated Anti-streptavidin）和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min;再次滴加总体积50 μL的终浓度为20 μg/mL鼠抗兔- Alexa Fluor 488（Alexa Fluor 488-Affinipure Mouse Anti-Rabbit）、终浓度为10 μg/mL链亲和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）孵育和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min，在每次孵育过后都需经过1×PBS洗涤各3次，洗涤过程均需在水平摇床（WD-9405B型）上中速震荡洗涤，每次洗涤时间分别是5、5、8 min。最后用40 μL 10 μg/mL的DAPI（抗淬灭剂稀释）染色，盖上盖片并用指甲油封片。实验过程在避光条件下进行。

1.2.5  镜检与分析  在雜交后的染色体标本正面滴加适量的镜油后，用荧光显微镜（型号BX51TR-32FA1-A03）观察，选择WBV荧光激发块，用Image-Pro Plus软件中文版6.0进行拍照保存，第3通道观察对染色体进行拍照，染色体呈蓝色，第2通道观察生物素标记的杂交位点为红色，第1通道观察地高辛标记的杂交位点为绿色，用Photoshop CS6软件和Adobe Illustrator CS6软件处理图片。

依照Song等[25]发布的信号位点百分距计算方法和高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97品种的核型所得的核型参数结合分析，本研究扩增信号位点在染色体上的位置用扩增信号位点到着丝粒的百分距离来衡量。公式如下：

2  结果与分析

2.1  HbAGL8和HbAGL15基因的FISH检测与物理定位分析

制作探针时，HbAGL8目的序列用生物素标记，HbAGL15目的序列用地高辛标记，然后进行双探针荧光原位杂交实验，以检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期均能同时检测到，并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图2A、图2B、图2C）;阴性对照试验中，不加入探针进行荧光原位杂交，用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图2D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97品种的核型所得的核型参数为依据，进行中期染色体核型分析，得到核型图（图2E）和核型模式图（图5）。结果表明，HbAGL8定位在5号染色体长臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值为39.71;HbAGL15位于4号染色体长臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值11.85。

2.2  HbAGL30和HbTT16基因的FISH检测与物理定位分析

制作探针时，HbTT16目的序列用生物素标记，HbAGL30目的序列用地高辛标记，进行双探针荧光原位杂交实验，检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期均能同时检测到，并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图3A、图3B、图3C）;阴性对照试验中，不加入探针进行荧光原位杂交，用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图3D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97品种的核型所得的核型参数为依据，进行中期染色体核型分析，得到核型图（图3E）和核型模式图（图5）。结果表明：HbTT16定位在1号染色体短臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值为22.19;HbAGL30位于7号染色体长臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值48.94。

2.3  HbAP1和HbSVP1基因的FISH检测与物理定位分析

制作探针时，HbAP1目的序列用生物素标记，HbSVP1目的序列用地高辛标记，进行双探针荧光原位杂交实验，检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期都能同时检测到，并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图4A、图4B、图4C）;阴性对照试验中，不加入探针进行荧光原位杂交，用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图4D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97品种的核型所得的核型参数为依据，进行中期染色体核型分析，得到核型图（图4E）和核型模式图（图5）。结果表明：HbAP1定位在13号染色体短臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值为18.01;HbSVP1位于8号染色体长臂上，信号位点到着丝粒的百分距离平均值6.70。

3  讨论

3.1  不同功能基因在橡胶树中的连锁关系

通过把巴西橡胶树MADS-box基因家族中的6个成员（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbSVP1和HbAP1）序列用DNAMAN分别两两进行序列比对，它们的相似度均在24.48%～ 66.40%之间，这说明它们之间的同源性不高，因此可利用原位杂交技术对这6个MADS-box基因家族成员进行物理定位分析，确定其在染色体上的具体位置。

本研究结果表明，已定位的MADS-box基因家族中的6个成员均位于不同的染色体上，遗传上可能互为独立基因的关系（图5）。结合前人已完成的其他功能基因定位的结果，可以得出：HbAGL15与HbWRKY7[27]、GGPS[28]、HbJAZ1、HbJAZ2[29]、HbCOI1[30]同时位于第4号染色体上;HbAGL8与HblMYC4[31]、HbRZF3[32]、HbNIN1[33]、HbMyb1[34]、HbNAC1[35]同时位于第5号染色体上;HbAGL30与HbWRKY75[27]、HEV1.2[36]、HbPT3[28]、HbRZF4[32]、HbSUT4[24]同时位于第7号染色体上;HbTT16与HbJAZ7[29]、HRT2[28]均位于第1号染色体上;HbAP1与HbWRKY2[27]、HblMYC3[31]、HbJAZ3[29]、SRPP[37]、HEV1.1[36]同时位于第8号染色体上。这些位于同一条染色体上的基因在遗传上可能互为连锁基因。

3.2  在橡胶树基因组组装中的辅助作用

随着全基因组测序工作的不断推进，中国热带农业科学院橡胶研究所于2016年5月完成了巴西橡胶树‘热研7-33-97品种的测序工作，并发布了其基因组草图[38]。但目前只是将contig（重叠群）拼接为大片段的scaffold，而众多scaffold尚未确定在哪条染色体上，故染色体归类并不清楚。本研究将MADS-box基因家族中的6个成员HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1基因的序列在NCBI中与巴西橡胶树‘热研7-33-97品种的全基因组序列进行比对，这6个成员分别位于全基因组中的scaffold0520、scaffold0451、scaffold2068、scaffold0063、scaffold1741和scaffold0673片段上。根据本研究对MADS-box基因家族中的6个成员定位的结果，可初步判定scaffold0451、scaffold0520、scaffold2068和scaffold0673分别位于第4、5、7和8号染色体长臂上;scaffold0063和scaffold1741分别位于第1和13号染色体短臂上。因此，本研究结果可为橡胶树基因组scaffold序列的染色体归属提供分子细胞遗传学依据。

3.3  对比分子标记基因定位的优势

用现有分子标记也能进行基因定位，关键环节包括：（1）根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体;（2）群体中不同植株的标记基因型的分析;（3）标记间连锁群的确定。其中构建分离群体是作图成功的关键[39]。选择合适的分子标记对群体中所有个体进行基因型分析，通过亲代与子代表现型的分离比例，可以判定基因与标记基因的连锁关系，从而确定基因与连锁群的连锁关系，其他功能基因也需要使用同样方法才能确定与连锁群的连锁关系，才能得知不同基因间的连锁关系，需要耗费大量的时间、人力和物力。但通过物理定位仅需将染色体标本通过FISH的方式，确定基因在染色体上的真实位置，通过其位置关系来初步推测它们的遗传关系，初步判断它们是否存在连锁，以及它们与其他已定位基因的连锁关系，更快更容易就能知道这些基因的遗传关系。

本研究所揭示的MADS-box基因家族中的6个基因分别在细胞核染色体上的物理位置，以及它们与其他已定位基因之间的位置关系，有助于进一步了解这些基因间可能的遗传关系，弥补了MADS-box基因家族分子细胞遗传学信息的空白，可为该基因家族在橡胶树分子调控机理的研究提供细胞核位置信息，从而为橡胶树分子辅助育种提供有力的科学依据。

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