miR-199a-5p对鹅颗粒细胞凋亡的影响及其机制

刘雅丽 荣玉静 胡深强 李亮 刘贺贺 何桦 夏露 胡继伟 胡博 王继文

摘要：为了揭示miR-199a-5p在鹅卵泡颗粒细胞凋亡中的作用及调控机制，本研究分离培养鹅等级卵泡颗粒细胞并转染miR-199a-5p相似物（mimic）和抑制物（inhibitor），采用qPCR法检测细胞凋亡相关基因的mRNA表达量;为进一步探究其作用机制，结合RNAhybrid和Targetscan 7.0预测miR-199a-5p靶基因，然后在中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中采用双荧光素酶报告系统检测miR-199a-5p对血管生成因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）3′UTR荧光素酶活性的影响，最后采用qPCR检测miR-199a-5p对鹅颗粒细胞VEGFA表达量的影响。结果显示，过表达miR-199a-5p能顯著升高BCL2/BAX比值（P<0.05），显著下调Caspase3 mRNA表达量（P<0.05）;抑制miR-199a-5p则显著下调BCL2/BAX值（P<0.05），对Caspase3 mRNA表达量无影响（P>0.05）。双荧光素酶报告载体系统发现，miR-199a-5p能极显著抑制VEGFA-WT报告载体荧光素酶活性（P<0.01），但对VEGFA mRNA表达量无显著性影响（P>0.05）。上述试验结果表明，miR-199a-5p可能通过抑制BAX和Caspase3表达量来抑制鹅颗粒细胞凋亡，但在鹅颗粒细胞中miR-199a-5p是否通过VEGFA调控细胞凋亡需要进一步研究。

关键词：miR-199a-5p;VEGFA;颗粒细胞凋亡;鹅;mimic;inhibitor

中图分类号：S858.33  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）23-0060-06

卵巢卵泡发育状况影响家禽繁殖性能和产蛋率，而影响卵泡正常发育的因素众多，其中颗粒细胞增殖分化或凋亡对卵泡发育具有重要作用[1]。颗粒细胞能合成多种活性肽，不仅可以调节垂体释放促卵泡素（FSH）影响卵泡发育，还能作为局部调节因子调控类固醇激素生成和细胞增殖，为卵泡生长发育所必需。禽类卵泡发育过程中大量发生闭锁，这个过程主要受颗粒细胞凋亡率调控。Johnson等发现，鸡卵泡闭锁起始于颗粒层并受颗粒细胞凋亡过程的调节[2-3]。

miRNA是一类长约18～25 nt具有调控功能的内源性非编码蛋白RNA[4]。目前在颗粒细胞中已经发现许多miRNA参与调控细胞增殖凋亡。对猪健康卵泡和闭锁卵泡测序后发现，miR-26b在闭锁卵泡中表达量显著升高，进一步研究发现其通过靶向ATM（共济失凋突变基因）促进颗粒细胞凋亡[5]。对水牛健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡测序后发现，包括 miR-21-5p 在内多个miRNA表达量随着卵泡闭锁程度增加先升高后下降，表明miR-21-5p可能参与了调控颗粒细胞凋亡[6]。FSH处理鸡颗粒细胞后能抑制细胞凋亡，对处理样品测序后发现包括let-7家族和miR-130/301家族在内的miRNA差异表达，表明它们可能在细胞凋亡中发挥了作用[7]。表皮生长因子（EGF）处理鹅等级前颗粒细胞后，能促进细胞增殖，miRNA测序后发现包括miR-26b、miR-27a、miR-27b等多个miRNA表达量显著上调[8]。笔者所在课题组通过对不同发育阶段卵泡颗粒层测序得到许多差异表达的miRNA，包括miR-199a-5p[9]。Donadeu等测序发现，miR-199a-5p在牛闭锁卵泡颗粒细胞中的表达量显著高于在健康卵泡颗粒细胞中[10]。对牛发情期第3天次级卵泡和优势卵泡的颗粒层测序后发现，miR-199a-5p在次级卵泡颗粒层中表达量显著高于在优势卵泡中，但在发情期第7天miR-199a-5p表达量趋势与之相反，说明miR-199a-5p在颗粒细胞中的作用可能与卵泡发育阶段有关[11]。目前miR-199a-5p在颗粒细胞中的研究只停留在测序水平，关于其在颗粒细胞中的功能及作用机制尚未报道。

目前，miR-199a-5p在禽类颗粒细胞中的作用尚未有报道，而颗粒细胞的凋亡率影响卵泡正常发育，因此本试验通过在鹅颗粒细胞中转染miR-199a-5p相似物（mimic）或抑制物（inhibitor）来过表达或抑制内源性miR-199a-5p表达。qPCR法检测细胞凋亡关键基因表达量，使用生物信息学预测 miR-199a-5p靶基因并通过双荧光素酶报告系统验证，最后qPCR法检测miR-199a-5p对靶基因表达量的影响。本研究结论旨在为进一步阐明miR-199a-5p在禽类颗粒细胞中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和细胞系

本试验动物材料选用在相同条件下饲养的健康、开产时间和体质量基本一致并处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅。试验动物来自四川农业大学家禽育种场，使用程序按照四川农业大学动物护理与使用指南进行;中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）购自中国科学院昆明动物研究所。试验于2018—2019年在四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室完成。

1.2 鹅颗粒细胞分离培养

将鹅颈部放血处死后取出卵泡，按照Gilbert等的方法分离F2～F4等级阶段卵泡颗粒层：在超净台中剪碎后加入0.05% Ⅱ型胶原酶（美国MPbio公司），在37 ℃水浴锅中消化，无明显块状物后终止消化[12]。离心后弃去上清，加入含10% FBS（胎牛血清，美国Gibco公司）和1%青链霉素混合液的DMEM/F12（杜尔贝科改良伊格尔培养基，美国HyClone公司）培养基重悬细胞，接种于12孔板，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 颗粒细胞转染

颗粒细胞培养48 h后，按照 Lipofectamine3000（美国英杰生命技术有限公司）说明书操作转染不同浓度的miR-199a-5p的相似物（mimic）和抑制物（inhibitor）。笔者所在课题组前期对鹅颗粒细胞miRNA进行测序，得到miR-199a-5p序列（5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3′），根据其序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成鹅miR-199a-5p的mimic和inhibitor，详见表1。每个试验组共设3个重复孔，24 h后使用RNAiso Plus[宝生物工程（大连）有限公司]收集RNA样品。

1.4 荧光定量PCR检测基因表达量

用RNAiso Plus提取细胞总RNA后，使用上海吉玛制药技术有限公司设计合成的miRNA&U6反转录与定量试剂盒检测miR-199a-5p的表达量。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ[宝生物工程（大连）有限公司]检测mRNA表达量。每个样本重复3次，miRNA和mRNA表达量计算分别以U6和β-actin为内参，本试验所用定量引物序列见表2。

1.5 靶基因预测与载体构建

根据靶基因预测网站Targetscan 7.0（http：//www.targetscan.org/vert_71/）和RNAHybrid（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid）預测到鹅VEGFA（XM_013200060.1）可能是miR-199a-5p的靶基因，在3′UTR处存在潜在结合位点。根据鹅VEGFA 3′UTR设计如下引物扩增包括潜在结合位点在内的片段：F：5′-cgagctcTCAGTACGGACGA-3′;R：5′-ctctagaGGCGAAGGTTGG-3′，引物5′端小写字母分别代表SacⅠ、XbaⅠ 酶切位点和保护碱基。将扩增产物胶回收后和pmirGLO质粒[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]使用SacⅠ、XbaⅠ内切酶（英国New England Biolabs公司）进行双酶切，再次胶回收后将扩增片段连接到pmirGLO质粒上得到野生型重组载体即VEGFA-WT。将野生型载体的潜在结合位点突变为其互补序列，得到突变型重组载体即VEGFA-MUT，点突变由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.6 双荧光素酶报告载体试验

CHO细胞系复苏后接种于培养皿中，待细胞长满后用胰酶消化，然后用含10% FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，以1×106～4×106个/mL的密度接种于96孔板。待细胞密度达到约70%～80%时，按照Lipofectamine 3000（美国英杰生命技术有限公司）说明书将miR-199a-5p mimic/NC分别与VEGFA-WT/MUT两两共转染，试验共设4个试验组，每组3孔重复值。

1.7 双荧光素酶活性检测

使用Dual-Luciferase Reporter试剂盒（Promega）检测荧光活性，检测前先将luciferase底物按要求溶解分装，-80 ℃备用。按试验需要量稀释1×裂解液，并按stop & Glo buffer ∶ stop & Glo底物=50 ∶ 1的比例现配stop & Glo底物备用。CHO细胞转染24 h后弃去培养基，PBS清洗1次，加入裂解液充分裂解细胞后将其转移到小EP管中。检测时先加入20 μL细胞裂解液和100 μL luciferase底物反应并读取A值，继续加入100 μL stop & Glo底物反应读取B值，A/B比值即为最终检测结果。

1.8 数据分析

使用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量[13]，使用GraphPad Prism 7.0软件的t-test检验分析数据并作图。

2 结果与分析

2.1 miR-199a-5p过表达和抑制效果检测

本试验中miR-199a-5p mimic设置30、90、150 nmol/L 3个转染浓度，检测miR-199a-5p过表达效果，结果见图1-A。miR-199a-5p mimic转染颗粒细胞24 h后，与各自对照组相比，90、150 nmol/L 浓度时miR-199a-5p表达量显著增加（P<0.05）。miR-199a-5p inhibitor设置50、100、150 nmol/L 3个转染浓度，结果见图1-B，100、150 nmol/L时，miR-199a-5p表达量均极显著减少（P<0.01或P<0.001），因此后续试验过表达组和抑制组定量样品转染浓度均选择150 nmol/L。

2.2 miR-199a-5p对颗粒细胞凋亡关键基因表达量的影响

由图2可知，过表达miR-199a-5p后，抗凋亡基因B-Cell CLL/Lymphoma 2（BCL2）与促凋亡因子BCL2 Associated X Protein（BAX）的比值（BCL2/BAX）上升，促凋亡基因Caspase3 mRNA表达量均下

降，与对照组相比差异显著（P<0.05）。抑制miR-199a-5p后，BCL2/BAX比值显著下降，但Caspase3表达量没有显著差异（P>0.05）。

2.3 miR-199a-5p靶基因预测与载体构建

通过Targetscan网站预测miR-199a-5p靶基因，从中挑选与颗粒细胞增殖凋亡相关的基因，最终选择VEGFA作为候选靶基因。将鹅VEGFA 3′UTR序列和鹅miR-199a-5p序列导入RNAhybrid网站中寻找二者的结合位点，结果见图3。设计引物扩增得到677 bp的VEGFA 3′UTR片段，包含潜在的结合位点。最终构建得到的野生型和突变型载体序列见图4。

2.4 miR-199a-5p靶基因鉴定

CHO细胞转染24 h后检测荧光活性，结果见图5。当过表达miR-199a-5p时，和对照组相比VEGFA-WT荧光活性被极显著抑制（P<0.01），说明二者之间存在结合位点;过表达miR-199a-5p对VEGFA-MUT荧光活性没有显著变化（P>0.05），说明二者不存在结合位点，即预测的结合位点正确，鹅VEGFA是 miR-199a-5p的靶基因。进一步在鹅颗粒细胞中检测VEGFA mRNA表达量（图6）发现，无论是过表达还是抑制miR-199a-5p表达，VEGFA mRNA表达量均没有显著差异（P>0.05）。

3 讨论与结论

已知BCL2和BAX是通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡的，二者比值降低促进凋亡，反之则抗凋亡[14]。本研究中过表达miR-199a-5p后BCL2/BAX比值显著升高，而抑制后比值显著下降，促凋亡基因Caspase3表达量也在过表达 miR-199a-5p 后显著下降，说明miR-199a-5p在鹅颗粒细胞中可能起到抑制细胞凋亡的作用。miR-199a-5p在颗粒细胞中的功能研究尚未有报道。Zhu等发现miR-199a-5p可以诱导心肌细胞和结直肠癌细胞凋亡[15-16]。在小鼠肝细胞中刺激内质网应激发生后，抑制miR-199a-5p表达可以促进细胞凋亡，表明 miR-199a-5p在肝细胞中起到抗凋亡的作用，抑制内质网应激引起的细胞凋亡[17]。此外miR-199a-5p还可以调控细胞增殖。在肝癌细胞中，miR-199a-5p调节缺氧诱导因子1α（HIF1A）和VEGFA抑制细胞增殖[18]。Ye等发现在结直肠癌细胞中，miR-199a-5p通过HIF1A/VEGFA 途径抑制细胞增殖，但不影响细胞凋亡和细胞周期[19]。

miRNAs的经典作用方式是通过与靶基因mRNA 3′UTR结合抑制靶基因表达，继而发挥不同功能。本研究使用Targetscan网站共预测到621个miR-199a-5p靶基因，从中筛选与颗粒细胞凋亡相关的基因，最终选择VEGFA基因作为候选基因。VEGFA基因编码肝素结合蛋白，诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，对于血管生成必不可少[20]。在小鼠颗粒细胞中慢病毒介导过表达VEGFA后，BAX和Caspase3表达量显著下降，抑制颗粒细胞凋亡[21]。在绵羊颗粒细胞中直接添加VEGFA可促进细胞增殖[22-23]。卵泡发育需要血管提供氧气，因此VEGFA还影响卵泡正常发育，直接向小鼠卵巢中注射VEGFA后，可促进卵泡数量增加和血管生成[24]。Hsu等发现上调miR-199a-5p可以通过靶向VEGFA的3′UTR抑制子宫内膜间充质干细胞增殖，验证了二者之间的靶向关系[25]。

由于Targetscan网站中预测靶基因与miRNA结合位点时不包含鹅，为了确定miR-199a-5p与鹅VEGFA基因潜在的结合位点，使用RNAHybrid网站导入鹅VEGFA 3′UTR与miR-199a-5p序列，预测二者可能的结合位点并构建野生型和突变型载体。本研究发现过表达miR-199a-5p后，VEGFA-WT报告载体荧光素酶活性显著下降，说明VEGFA是miR-199a-5p的靶基因。当突变二者的潜在结合位点后过表达miR-199a-5p对VEGFA-MUT报告载体荧光素酶活性无影响，证明预测的结合位点正确。本研究进一步检测miR-199a-5p对VEGFA表达量的影响时发现，无论是过表达还是抑制miR-199a-5p表达，都不影响颗粒细胞中VEGFA mRNA的表達量，表明miR-199a-5p是在翻译水平调控VEGFA蛋白表达。在人子宫内膜基质细胞中，miR-199a-5p通过与VEGFA 3′UTR结合抑制其蛋白表达量，但不影响mRNA表达量[26]。

miRNA靶基因众多，在不同发育阶段或组织细胞中起主效作用的靶基因可能存在差异，而单个靶基因又会同时受到多个miRNA调控，共同构成复杂的调控网络[27-28]。目前众多研究表明，VEGFA在颗粒细胞中行使促进细胞增殖和抗凋亡的作用，而本研究发现miR-199a-5p在鹅颗粒细胞中可能发挥抑制细胞凋亡的作用，因此推测miR-199a-5p在鹅颗粒细胞中抗凋亡功能可能不是通过靶基因VEGFA实现的，或者说VEGFA在此过程中作用很小，不是主效靶基因，仍需要进一步试验探究。

本研究发现miR-199a-5p可能抑制鹅颗粒细胞凋亡，并通过双荧光素酶报告系统验证了VEGFA是miR-199a-5p的靶基因，但是 miR-199a-5p抑制鹅颗粒细胞凋亡的功能是否通过VEGFA通路实现需要进一步研究。本研究初步探讨miR-199a-5p在禽类颗粒细胞中的功能及可能机制，为深入探究miRNA在禽类卵巢颗粒细胞中的功能提供理论依据。

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