温胆汤对脑缺血/再灌注损伤大鼠行为学及海马中5-HT、MDA、DA、β-EP表达的影响

张金霞 方芳

[摘要] 目的 觀察温胆汤对脑缺血/再灌注损伤模型大鼠行为学、海马中5-羟色胺（5-HT）、丙二醛（MDA）、多巴胺（DA）、β-内啡肽（β-EP）表达的影响。 方法 将30只大鼠随机分为空白组、模型组、尼莫地平组、温胆汤高剂量组、温胆汤低剂量组5组，每组各6只，空白组仅分离颈内动脉，给予生理盐水10 mL/kg灌胃;其余大鼠采用Longa法线栓建立缺血/再灌注模型，模型组给予生理盐水10 mL/kg灌胃;尼莫地平组给予尼莫地平悬浮液20 mg/kg;温胆汤高剂量组和低剂量组分别给予温胆汤4 g/kg、2 g/kg，给药体积及给药频率均相同。连续给药14 d后对所有大鼠进行Morris水迷宫测试。完成行为学检测后，分离出大鼠双侧海马，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定海马组织中DA、5-HT、β-EP、MDA的表达。 结果 与空白组比较，各组动物水迷宫游泳总路线均明显增加，与模型组比较，各给药组水迷宫游泳总路线明显缩短，其中温胆汤高剂量组在D3、D5时差异显著（P<0.05），在D4时有差异极显著（P<0.01）;温胆汤低剂量组在D4时差异显著（P<0.05）。5-HT各给药组较模型组有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;DA各给药组较模型组有上升趋势，差异有统计学意义（P<0.05）;β-EP各给药组较模型组有下降趋势，且温胆汤高剂量组差异显著（P<0.05）;MDA各给药组较模型组均有下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 缺血/再灌注可导致海马神经元损伤，温胆汤能有效改善脑缺血/再灌注大鼠的神经损伤症状，影响海马组织中细胞因子及神经递质的含量。

[关键词] 温胆汤;缺血/再灌注;认知功能;海马

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）33-0038-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Wendan Decoction on the ethology of rats with cerebral ischemia/reperfusion injury and the expressions of 5-hydroxytryptamine（5-HT）， malonaldehyde（MDA）， dopamine（DA） and β-endorphin（β-EP） in their hippocampi. Methods Thirty rats were randomly divided into five groups： blank group， model group， Nimodipine group， Wendan Decoction high-dose group and Wendan Decoction low-dose group， with 6 rats in each group. In the blank group， only internal carotid artery separation was performed and normal saline（10 mL/kg） was given to the rats by gavage. The rats in other groups were treated with Longa to establish the ischemia/reperfusion model. The rats in the model group were given normal saline（10 mL/kg） by gavage. Rats in Nimodipine group were given Nimodipine suspension liquid by 20 mg/kg. Rats in the Wendan Decoction high-dose and low-dose groups were given Wendan Decoction by 4 g/kg and 2 g/kg respectively. All the dosage volume and frequency were the same. All rats were given Morris water maze tests after 14 days of continuous administration. After completing the behavioral test， the rats' bilateral hippocampi were isolated， and the expressions of DA， 5-HT， β-EP and MDA in the hippocampus were determined by ELISA. Results Compared with the blank group， the total swimming routes of the other groups were significantly increased. Compared with the model group， the total swimming routes of drug administration groups were significantly shortened. There were significant differences between the Wendan Decoction high-dose group and the model group at D3 and D5（P<0.05）， and high statistically difference at D4（P<0.01）. There was significant difference between the model group and the Wendan Decoction low-dose group at D4（P<0.05）. Compared with the model group， 5-HT expression in each drug administration group showed a downward trend， but there was no significant difference（P>0.05）. Compared with the model group， DA expression in each drug administration group showed an upward trend， and there were significant differences between those groups and the model group（P<0.05）. Compared with the model group， β-EP expression in each drug administration group showed a downward trend， and β-EP expression in the Wendan decoction high-dose group was significantly less than that in the model group（P<0.05）. Compared with the model group， MDA expression in each drug administration group showed a downward trend， and there were significant differences between those groups and the model group（P<0.05）. Conclusion Ischemia/reperfusion can lead to hippocampal neuron injury. Wendan Decoction can effectively improve the symptoms of nerve injury in cerebral ischemia/reperfusion rats， and affect the content of cytokines and neurotransmitters in hippocampal tissues.

[Key words] Wendan Decoction; Ischemia/reperfusion; Cognitive function; Hippocampus

脑缺血/再灌注损伤可引起脑功能障碍而产生获得性智能损害综合征，即血管性痴呆。痴呆是一个全球性的问题，根据流行病学研究，在1980～2011年，我国社区≥55岁人群的血管性痴呆患病率呈缓慢上升趋势，发病率随年龄增长而升高[1]。其临床上表现出非特异属性，目前仍没有最有效且持久的医治方式[2]。中医以辨证论治与整体观念相结合，与现代医学相比，对疾病的治疗具有独特性，但却缺乏科学依据。温胆汤出自南北朝的《集验方》，全方苦辛、寒温平调，从调理脾胃气机入手，使枢轴旋转而诸脏腑气机调畅，则浊邪可祛。本研究以温胆汤对脑缺血/再灌注损伤大鼠行为学及海马中5-HT、MDA、DA、β-EP表达的影响为切入点，初步探讨加减温胆汤治疗血管性痴呆的作用机制，为温胆汤治疗血管性痴呆的临床实践提供科学依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用30只健康SD大鼠（雌雄各半），购入时体重为200～220 g，实验时体重240～270 g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，合格证号：032582。饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）的规定。维持饲料由江苏协同生物工程有限公司提供，执行标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》。实验动物房使用许可证号：SYXK（浙）2015-0008，饲养环境：温度范围20～25℃，相对湿度范围40%～70%。大鼠试验前在动物房环境中适应6 d。

1.2 主要试剂及仪器

水合氯醛，购于上海展云化工有限公司，批号：160220;水迷宫，产家淮北正华，型号：ZH0065;5-羟色胺（5-HT）试剂盒（cat#H104）、多巴胺（DA）试剂盒（cat#H17）及丙二醛（MDA）试剂盒（cat#A003-1），均购于南京建成生物工程研究所;β-内啡肽（β-EP）ELISA kit（cat#CEA806Ra）购于青岛尤尔生生物有限公司;全波长酶标仪，MD公司SpectraMax Plus384型。中药温胆汤：半夏6 g，茯苓4.5 g，竹茹6 g，枳实6 g，陈皮9 g，炙甘草3 g，加药材量的8倍水浸泡30 min后沸腾煎40 min，过滤取汁，重复上述煎煮过程2次，合并水煎液，用旋转蒸发仪浓缩为1.2 g（生药）/mL，置于4℃冰箱保存备用。

1.3 方法

1.3.1 实验分组  采用随机数字表法将30只大鼠分为5组，每组各6只，雌雄各半。空白组取6只仅分离颈内动脉，给予生理盐水10 mL/kg灌胃;模型组建立缺血/再灌注模型，给予生理盐水10 mL/kg灌胃;尼莫地平组建立缺血/再灌注模型后，给予尼莫地平悬浮液20 mg/kg;温胆汤高剂量组和低剂量组在建立缺血/再灌注模型后，分别给予温胆汤4 g/kg、2 g/kg，给药体积及给药频率均相同。

1.3.2 缺血/再灌注动物模型的制备  采用Longa法线栓制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈部常规消毒备皮，取颈正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，用血管夹暂时夹闭颈总动脉近心端、颈内动脉。在颈外动脉靠近颈总动脉分叉处剪一小口，插入一端经硅胶包被的特制线栓。松开颈内动脉上的血管夹，将线栓轻轻由颈外动脉插入颈内动脉，直至线栓堵塞大脑中动脉的起始部，线栓插入深度一般为18～20 mm，扎紧线栓，松开颈总动脉上的血管夹，缝合颈部皮肤。缺血2 h后，拔出线栓，恢复血流再灌注，造模后3 d内肌注10万U青霉素钠抗感染。

1.3.3 神经功能评分  大鼠模型造模完成后，均出现神经功能障碍，待大鼠苏醒后依据Zea Longa 5分制標准[3]筛选，Longa评分为2分或3分。评分标准：0分：无神经功能缺损症状，活动正常;1分：不能伸展对侧前爪;2分：爬行时出现向左转圈;3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒;4分：不能自发行走，意识丧失。1～3分视为造模成功。

1.3.4 测试方法  连续给药14 d后对所有大鼠进行Morris水迷宫测试，检测大鼠空间学习记忆能力。①定位航行试验：第1天进行可视平台试验，实验前将大鼠笼放入测试房间适应至少30 min，使大鼠适应新的环境，期间避免其看到水池。试验时，将大鼠从离平台最远的象限入水，记录大鼠找到平台的潜伏期，时间为90 s。第2天至第5天，隐藏平台试验，每天固定时间进行4次训练，每次90 s，每次间隔20 s，图像采集系统及分析系统自动记录保存大鼠的运动轨迹、找到站台的潜伏期、游泳时间、游泳速度、游泳距离及寻找站台的搜寻策略等信息。②空间探索试验：第6天撤除平台，从任一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录90 s内大鼠的游泳轨迹，并进行分析。观察大鼠停留目标象限和其余各象限的游泳时间与路程等指标。

1.3.5 检测海马组织中DA、5-HT、β-EP、MDA的表达  完成行为学检测后，断头处死大鼠，取出脑组织，于脑视交叉与视乳头之间冠状位处垂直切开脑组织，钝性分离出的左右双侧海马，迅速加入冰生理盐水，制成质量分数为10%的脑组织匀浆，采用ELISA法测定海马组织中DA、5-HT、β-EP、MDA的含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两样本t检验;非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对大鼠水迷宫隐藏平台试验游泳总路程的影响

结果显示，与空白组比较，各组动物水迷宫游泳总路线均明显增加，与模型组比较，各给药组水迷宫游泳总路线明显缩短，其中尼莫地平组在D3、D4、D5时差异显著（P<0.05）;温胆汤高剂量组在D3、D5时差异显著（P<0.05），在D4时差异极显著（P<0.01）;温胆汤低剂量组在D4时差异显著（P<0.05）。见表1。

2.2 DA、5-HT、β-EP、MDA在海马组织中的含量

结果显示，DA：模型组较空白组有下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）;尼莫地平组及温胆汤高剂量组较模型组均有上升趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。5-HT：模型组较空白组有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;各给药组较模型组均有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。β-EP：模型组较空白组有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;各给药组较模型组有下降趋势，且温胆汤高剂量组差异显著（P<0.05）。MDA：模型组较空白组有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;各给药组较模型组均有下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

以往研究表明，卒中后可引起血管性痴呆，且患病率较高[4-5]。其临床表现主要为认知功能减退、记忆障碍、日常生活能力下降及社会功能减退等，严重影响患者生命健康，增加家庭负担[6-7]。以往临床关注点更多的集中在卒中患者的运动功能，而忽略了认知功能的管理。近年对血管性痴呆的认识及研究越来越多，血管性痴呆是迄今为止唯一可以防治的痴呆，但因为缺乏特效药物，所以除对患者的生活质量会产生严重影响外，还会对家庭及社会经济产生极大的经济负担，寻找血管性痴呆有效的治疗方法是临床关注的热点。脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键的方法，但再灌注后可加重缺血脑组织的损伤，而脑缺血-再灌注损伤机制复杂，涉及能量代谢障碍、自由基作用、内皮素作用、神经元凋亡、兴奋性氨基酸毒性作用及细胞内钙超载等诸多因素[8-13]。该研究证明，血管性痴呆发病机制与脑缺血-再灌注后细胞凋亡、炎症反应及脑神经相关肽的减少有关。有临床研究表明，温胆汤及其加减方在早期血管性痴呆治疗中有一定的疗效，可以改善患者认知功能[14-16]。但温胆汤治疗血管性痴呆的机制尚缺乏实验依据。本实验证明，温胆汤可改善脑缺血-再灌注损伤后大鼠的认知功能，可能与以下几个机制有关，①提高单胺类神经递质：在VD的发病过程中，大脑海马部的神经递质明显减少，尤其是单胺类神经递质减少与VD的智力下降密切相关。脑缺血时脑组织中单胺氧化酶活性升高，分解单胺类神经递质，使脑内DA水平下降，影响学习记忆。本研究结果显示，温胆汤对脑缺血再灌注损伤大鼠海马的DA有改善作用，但5-HT改善不明显，可能与5-HT系统更多的是参与调节情绪、动机和食欲等有关[17]，而DA则与记忆相关。②自由基作用：大鼠脑缺血再灌注损伤后大量的自由基形成，攻击脑细胞膜中多不饱和酸双键造成脑细胞膜结构的破坏，还可以继续损伤蛋白与核酸，引起细胞凋亡，而MDA是自由基作用于细胞膜脂质发生过氧化反应后的氧化终产物，通过测定其含量可以了解氧自由基导致机体组织细胞损伤的程度。本研究结果显示，模型组MDA含量升高，这与一些文献报道一致[18]，温胆汤低剂量组和高剂量组中MDA含量均显著下降，说明温胆汤可通过清除氧自由基，保护细胞膜的结构。

本研究选取的β-EP是一种内源性阿片样物质，分布于中枢神经系统，与神经损伤和修复密切相关，β-EP的过度表达可加重缺血性脑损伤，与其升高时引起超氧化物生成和细胞内Ca2+释放有关，其含量某种程度上反应脑损伤的程度。本研究发现，温胆汤高剂量组与模型组相比，β-EP在海马中的含量下降，并有显著性差异，这与既往一些文献报道相一致[19-20]，说明温胆汤对损伤的脑组织具有修复作用，但其作用机制目前尚不明确，且与此研究样本量较小有关，还需要增大样本量，做更细化的研究。

在本研究中分别使用温胆汤高剂量组及低剂量组，这在过去的研究中尚未有先例，结果也证明不同剂量的药物组在改善大鼠记忆能力及海马组织中单胺类神经递质的含量改善有差别，为以后寻找更适合剂量的药物浓度，改善血管性痴呆患者认知功能提供了一定的依据，在此后的研究中，可能需更细化剂量分组。从大量的实验研究和本研究结果来看，尼莫地平及温胆汤具有很多类似的脑保护作用，但作用机制不相同。尼莫地平为治疗缺血性卒中患者认知和行为能力减退的有循证医学依据的药物，其具有可选择性扩张脑血管作用，从而达到对局部脑缺血的保护作用，也有研究证明[21]，尼莫地平可提高VD大鼠的记忆能力。本研究表明，尼莫地平同样可以改善脑缺血-再灌注损伤后大鼠的认知功能，提高海马组织中DA水平，降低MDA含量。

血管性痴呆属于祖国医学中“痴呆”范畴，但其病因病机与阿尔茨海默病有所区别，阿尔茨海默病即老年痴呆，多数学者认为是年高肾精亏虚，髓海不足，神明失其所养所致，治疗从属髓海不足，肾气亏虚等虚症较多[22-23]，而血管性痴呆在中风病的基础上形成，久病入络，痰瘀内阻，败坏脑髓形体而致神明不得所用，多从痰从瘀论治，《石室秘录》有曰：“呆病如痴，……实亦胸腹之中，无非痰气。故治呆无奇法，治痰即治呆也。然而痰气最盛，呆气最深……”，说明痴呆与痰氣有关，且痴呆的程度与痰浊的轻重有关，可见化痰祛浊可为临床治疗血管性痴呆常用的方法。温胆汤最早记载于《集验方》，但后代医家常习用陈无择《三因极一病证方论》所载方。原文记载：“治心胆虚怯……遂致心惊胆慑，气郁生涎，涎与气搏，变生诸证，……。”，具有理气化痰，和胃利胆之功效，主治胆郁痰扰之证。方中君药半夏燥湿化痰，降逆和胃;臣以竹茹清胆和胃，止呕除烦;枳实、橘皮理气化痰，使气顺则痰自消;茯苓健脾渗湿，湿祛则痰不生;甘草益脾和中，调和诸药。诸药合用，可使痰浊得去则胆无邪扰，气通血行则脑窍得养。临床上亦常以温胆汤治疗痰气所致的诸多怪症，此研究为温胆汤治疗血管性痴呆提供一定的理论依据，为临床上抗VD药物的筛选提供实验依据。

综上所述，温胆汤和尼莫地平可以通过清除氧自由基、提高海马区部分单胺类神经递质来改善缺血再灌注大鼠模型的记忆功能，这可能是温胆汤治疗血管性痴呆的机制之一。

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（收稿日期：2020-04-01）