hACE2转基因小鼠模型*

赵 亚 师长宏

(空军军医大学实验动物中心，西安 710032)

2020年一月底，一场不明原因的肺炎疫情席卷全世界，2月28日已经被世界卫生组宣布为全球风险非常高级别。目前，已造成全球4 000多万人感染，100多万人死亡，此数据仍在不断增长，严重危害到人类的健康和社会稳定。大量研究表明，此次肺炎为病毒性肺炎，是由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SRAS-CoV-2)感染所致。相关研究表明，血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是新型冠状病毒及SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SRAS-CoV)的受体[1-3]，与SRAS-CoV-2亲和力高于SRAS-CoV[4]， 是本次新型冠状病毒的药物治疗及疫苗研发靶点。

ACE2是一种锌金属蛋白酶，结构包括一个信号肽、一个金属蛋白酶活性位点和一个跨膜区，可降解血管紧张素Ⅰ(angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)生成九肽(angiotensin 1-9， Ang1-9)，降解血管紧张素(angiotensin，angi)生成七肽(angiotensin 1-7，Ang1-7)[5-6]。ACE2位于X染色体上，是血管紧张素转换酶(renin-angiotensin system，RAS)中的一员，在肺、消化道及大脑等组织器官中广泛表达[7]。ACE2在肺组织中主要分布于Ⅱ型肺泡细胞(type Ⅱ alveolar cells，AT2 cells)，也有少量分布于Ⅰ型肺泡细胞(AT1 cells)及气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等[8-9]，冠状病毒进入并在这些靶细胞中复制，然后，成熟的病毒粒子从感染细胞中释放出来，再去感染新的靶细胞[10]。

我国学者最新研究发现了ACE2识别新型冠状病毒的结构基础，西湖大学周强教授课题组在《bioRxiv》连发两篇文章清楚解析了新型冠状病毒如何侵袭人体宿主细胞，相关结果为后期研究人员改进并开发新型治疗药物提供了非常重要的线索和信息[11-12]。《Science》发表了美国国立卫生研究院(NIH)和德州大学奥斯汀分校(UT Austin)的合作研究成果，通过冷冻电镜技术解析了新冠病毒S蛋白三聚体结构，发现新冠病毒S蛋白与受体ACE2结合能力为SARS病毒的10～20倍[4]，揭示了新冠病毒传播能力如此强悍的原因。

近期《Cell》发表了来自德国研究者的结果也证实，新冠病毒利用ACE2进入细胞，利用丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白，TMPRSS2抑制剂可阻止病毒进入细胞，且来自恢复期SARS患者的血清可中和SRAS-CoV-2 S蛋白驱动的病毒进入细胞，揭示SRAS-CoV-2和SARS病毒感染之间的重要共性[13]，为疫情提供新的治疗思路。

病毒相关药物和疫苗研究均需要在特异性动物模型上进行实验后，才能进入临床实验阶段。小鼠是目前各类疾病研究中应用最广泛的动物模型，也是本次研究的首选。hACE2转基因小鼠作为SARS-CoV易感动物模型，与野生型小鼠相比，经鼻腔接种PUMC01株SARS-CoV后，动物出现典型的间质性肺炎，并伴有脑组织、肝脏、肾脏和胃肠道等肺外组织的损伤，在研究SARS发病机制和抗病毒药物的评价具有重要作用。国内外均有成功报道的hACE2转基因小鼠模型，但这几种转基因小鼠由于应用技术、整合方式及小鼠品系等方面的差异，造成遗传背景及表型不同。本文将对现有的各种hACE2转基因小鼠从品系、构建方式及应用领域等方面进行系统的介绍，利于研究者选择使用。

1 C57BL/6 J × SJL/J背景K18-hACE2转基因小鼠

2007年，爱荷华大学的McCray等[14]成功构建K18-hACE2转基因小鼠，由人类细胞角蛋白18(cytokeratin 18，K18)启动子调控的hACE2转基因小鼠。将携带有人ACE2编码基因的载体引入到野生型(c57BL/6 J 与SJL/J杂交品系的F2)小鼠中构建。ACE2的表达由人细胞角蛋白18(K18)启动子调控在上皮细胞中表达，K18启动子可在气道上皮细胞(但不在肺泡上皮细胞)以及其他内脏(包括肝、肾和胃肠道)的上皮细胞中高效表达外源转基因[15]。

McCray等研究发现，在最初感染的气道上皮细胞中便观察到hACE2表达。该K18-hACE2转基因小鼠鼻内接种人源SARS-CoV毒株后会迅速感染并死亡，但野生型小鼠感染SARS-CoV病毒后，其肺泡中并未检测到病毒抗原。该研究中，病毒感染开始于气道上皮，随后扩散到肺泡，最终蔓延至大脑。感染导致肺部巨噬细胞和淋巴细胞浸润，并引起肺部和脑部的促炎细胞因子和趋化因子上调。感染3～5 d后，K18-hACE2小鼠出现体质量减轻，并伴有呼吸困难和精神萎靡，7 d内全部死亡。虽然，SARS-CoV可以感染K18-hACE2转基因小鼠的气道和肺泡，引起的肺部病理变化却有限，且最后受感染的K18-hACE2转基因小鼠死亡的主要原因是中枢神经系统感染后导致神经元死亡[14-16]，而新冠病毒感染患者死亡主要原因是感染后的肺脏炎症[17]。

2 C3H × C57BL/6 背景HFH4-hACE2转基因小鼠

美国病毒学家北卡罗纳大学的Sheahan等[18]构建的(C3H×C57BL/6)F1 背景hACE2转基因小鼠，命名为HFH4-hACE2转基因小鼠。该小鼠使用肺纤毛上皮细胞启动子HFH4启动人源ACE2基因在小鼠肺中的转基因小鼠表达，该HFH4-hACE2转基因小鼠肺中虽观察到人ACE2的有效表达，但没有表现出预期的肺部特异表达，在脑、肝、肾和胃肠道中也检测到不同程度的人ACE2表达。同时，在HFH4-hACE2转基因杂合子小鼠中偶尔检测不到人类ACE2基因的表达。在HFH4-hACE2转基因小鼠10～20周龄时，感染SARS-CoV Urbani株并观察7 d后发现，感染小鼠体质量平均下降了20%以上，并且病毒在肺和脑保持了强劲复制，研究者预测hACE2转基因小鼠死亡的主要原因为致命性脑炎。

3 C57BL/6 J×C3H/HeJ背景的hACE2转基因小鼠

美国德克萨斯大学加尔维斯敦社区学院构建了5个转基因谱系的(C57BL/6 J×C3H/HeJ)F1背景的hACE2转基因小鼠，分别命名为AC-12、AC-22、AC-50、AC-63和AC-70，主要应用其中的AC-22、AC-63及AC-70转基因谱系进行相关实验。该hACE2转基因小鼠使用外源性的复合启动子CAG(带有CMV-IE增强子的鸡β-肌动蛋白启动子)启动人ACE2基因表达[19]。该团队研究显示，此类hACE2转基因小鼠在肺、脑、心及肌肉等组织中均有hACE2mRNA表达，对SARS-CoV感染高度易感，可导致不同严重程度的疾病发生，部分家系甚至死亡；在5个转基因谱系中，AC-70转基因谱系小鼠病毒感染能力最强，免疫抵制最剧烈，但在研究中未发现弥散性肺泡损伤，Yoshikawa等[20]推测该谱系转基小鼠最终死亡可能是因感染导致的致命性脑炎。

4 ICR背景hACE2转基因小鼠

中国医学科学院医学实验动物研究所秦川教授团队制作的hACE2转基因小鼠为ICR背景hACE2转基因小鼠。该团队考虑到外源性hACE2导入可能会造成小鼠心血管系统功能失常，采用内源性启动子，使导入的hACE2基因更接近于自然表达，导入的hACE2基因为单拷贝，临床观察该转基因小鼠无心血管系统副作用，ICR背景的hACE2转基因小鼠SARS-CoV易感性明显高于野生型小鼠。研究表明，经鼻腔接种PUMC01株SARS-CoV后，该转基因小鼠在接种后第3天及第7天的肺组织上清的病毒载量和病毒滴度均显著高于野生型小鼠，出现典型的间质性肺炎，并伴有肾脏、心脏、肝脏、脑组织和胃肠道等肺外组织的损伤；在感染1周内，该转基因小鼠虽活动减少、嗜睡，未出现死亡，推测这可能是由于感染的病毒滴度较低或者转基因的表达较低[21-24]。

在疫情发生期间，科技部启动了新型冠状病毒科技攻关的第1批应急项目，中国医学科学院实验动物研究所主持动物模型构建课题，同时与中国疾控中心病毒病预防控制所等院内外单位密切合作，根据前期的工作基础和经验，结合生物信息学分析，从病原易感动物资源库中筛选了潜在的易感动物，分别是SARS入侵人细胞的受体—hACE2转基因小鼠，以及曾成功用于SARS动物模型研制的恒河猴。并率先建立了转基因小鼠模型和恒河猴新冠肺炎(SRAS-CoV-2)的疾病模型，丰富了对COVID-19病因学和病理学的认识，为进一步研究感染与发病机制、传播途径、药物和疫苗评价等提供了不可缺少的关键支撑。上述hACE2转基因小鼠模型已经应用于致病机制和传播途径研究、应急药物筛选和疫苗评价，在科技部和中国医学科学院的安排下，完成了5种成药的评价，正在进行6种疫苗和4种成药的动物实验评价。值得一提的是， SARS和MERS疫情期间，该研究所均率先建立了动物模型，应用于致病机制研究、疫苗研发和药物筛选[25-26]。

5 KM背景hACE2转基因小鼠

中国人民解放军军事科学院在KM小鼠上采用同源重组的方式进行转基因小鼠制备，利用PCAGGS表达载体，采用外源性启动子。该启动子为包含CMV增强子和鸡的β-actin启动子组成的CAG杂合启动子，载体还包括鸡β-actin的外显子及兔β球蛋白的部分外显子3，鸡β-actin的部分内含子1和兔β球蛋白的部分内含子2，以及兔β球蛋白的转录终止子。其中，在鸡的β-actin外显子3中存在转录拼接位点，在鸡的β-actin内含子中存在转录增强子序列，有利于增强下游基因的表达；该团队在目的基因hACE2的起始密码子前加入了CCACC的Kozak序列，有文献表明在该启动子前加入该序列能够增强目的基因表达[27]。该团队通过Western blot 及组织免疫荧光检测了转基因小鼠肺组织中的hACE2蛋白表达和分布，并通过体外蛋白结合实验证明小鼠肺组织中稳定表达的hACE2蛋白能很好的与SARS病毒的S蛋白结合[28]。该转基因小鼠也存在感染后小鼠脑组织中病毒含量过高，最终导致小鼠因病毒在脑中广泛传播继而因出现致命性脑炎死亡[29]。

6 展望

早期在CRISPR/Cas9技术还未成熟时，转基因小鼠的构建主要通过受精卵DNA显微注射技术制作，因重组效率及启动子的不同，其表达效果间存在差异，使得这些转基因小鼠不能完全模拟生理状况下的ACE2表达水平。在感染SARS-CoV后外源性与内源性的启动子启动的hACE2转基因小鼠模型均出现气道上皮感染症状，但这些转基因小鼠脑内都有高水平的hACE2表达，相应的在感染后小鼠脑组织中病毒含量过高，最终可能导致小鼠因病毒在脑中广泛传播继而出现致命性脑炎[16, 18, 20, 23]。无论现已报道的SARS-CoV hACE2转基因小鼠模型在研究发病机制和治疗干预方面多有效，但其小鼠适应性的改变人类冠状病毒易感性及致病机制这些缺点依然存在[30]。

国家卫生健康委员会3月3日最新修订的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中对病理改变进行了总结，新型冠状病毒肺炎导致的病理改变以肺脏及免疫系统损伤为主，其他脏器因基础病不同而不同，多为继发性损害；肺脏呈不同程度的实变，各类上皮细胞发生病理性变化，支气管黏膜上皮和Ⅱ型肺泡上皮细胞胞质内可见冠状病毒颗粒，部分肺泡上皮和巨噬细胞呈新型冠状病毒抗原阳性、核酸阳性；其他器官的病理改变，包括脑组织充血、水肿及部分神经元变性，肾上腺见灶性坏死，食管、胃和肠管黏膜上皮不同程度变性、坏死、脱落[31]。相应的动物模型感染新冠病毒后其病理学变化应尽可能接近人的临床特征。但目前所有的SARS-CoV-2感染的动物模型均只能重现人类疾病的部分方面，也不能完全模拟病毒攻击时人体生理状况下的反应。因此，应积极开发不同类型的SARS-CoV-2感染动物模型，加速研究SARS-CoV-2发病机理，加快开发COVID-19对应策略。

因此，各国研究者均积极的开发新的SARS-CoV-2感染小鼠模型。CRISPR/Cas9技术是理想的转基因小鼠模型构建手段，能够将hACE2序列定点插入小鼠内源ACE2基因ATG位置，使人源ACE2能够在内源ACE2调控信号的调控下进行表达，其表达将更贴近于小鼠生理状态下的表达情况，可以更好地为药物治疗及疫苗研发提供夯实的动物基础。已有研究者利用CRISPR/Cas9介导的基因工程技术在小鼠上实现人ACE2替换鼠ACE2。

耶鲁大学医学院的Iwasaki教授课题组开发了一种新的SARS-CoV-2感染小鼠模型，首先使用携带hACE2基因的无害病毒感染小鼠，感染后小鼠产生人ACE2蛋白，进而该小鼠感染SARS-CoV-2发现，SARS-CoV-2可以在这些小鼠中复制并诱导类似于在COVID-19患者中观察到的炎症反应，在该模型中，多种免疫细胞被激活并募集到肺中[32]。

各类hACE2转基因小鼠对新型冠状病毒机理研究、药物治疗及疫苗研发均有至关重要的作用，通过hACE2转基因小鼠进行不同药物的筛选，不仅可以提高临床前药物验证的有效性，也提高可以临床实验的成功率。目前，我国多家企业及单位已经着手开发利用CRISPR/Cas9技术开发新的hACE2转基因小鼠模型，相信不久之后就会有大量不同敲入位点及修饰方法的hACE2转基因小鼠模型用于后续的药物研发及疫苗制备工作中。研究者可根据自身需求选用不同种类的hACE2转基因小鼠进行相关实验。