骨关节炎动物模型的概述*

唐玉玲 王 进 邱业峰 袁 征

(军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一类包括关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜以及关节周围肌肉等结构发生病变所致的关节退行性疾病[1-2]。临床表现为关节疼痛及压痛、关节僵硬及肿胀、关节活动摩擦、关节畸形以及肌肉萎缩等，常导致患者活动障碍甚至发生残疾[3]。世界卫生组织统计数据显示：到2020年OA可能成为人类第四大致残疾病[4]。随着全球人口老龄化和肥胖的加剧，OA的发生更为普遍，不仅严重影响患者个人身心健康、对全球公共卫生事业及现代社会经济也造成了严重负担[5-6]。OA动物模型的研制对研究OA发生发展中的遗传机制、预防以及治疗都有着重要意义。目前OA动物模型主要包括三类：自发性OA动物模型、诱发性OA动物模型以及转基因OA动物模型[7]。

1 自发性OA动物模型

自发性OA动物模型指不经过人为干预，在自然条件下发生OA的动物。已有的自发性OA动物模型中，Hartley豚鼠模型[8]在18～22月龄间发生中至重度的骨关节炎；C57小鼠模型中2月龄小鼠OA发生率为25%，16月龄时达80%，但缺乏人类OA的关节软骨纤维化的表型[9]。然而，人为喂养高脂饲料或是增加运动负荷后能增加C57小鼠的OA自发率[10-11]。其次，STR/ort小鼠也是公认的自发性OA动物模型[12-14]，其膝关节、踝关节、肘关节和颞下颌关节等均是OA的好发部位。此外，来源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[15]也能够自发发生OA。这一小鼠踝关节发生典型的OA损伤表型，关节肿胀畸形，关节软骨变薄并产生裂隙及侵蚀，关节边缘形成骨赘，并且随着鼠龄增长小鼠常发生瘫痪。

2 诱发性OA动物模型

诱发性OA动物模型指通过人为操作对动物骨关节及周围组织进行手术或非手术的干预从而诱导OA发生的动物。诱发性OA动物模型在大鼠、小鼠、兔、犬、猪、绵阳、马等多个不同物种中都有报道[16]。按造模方法不同，诱发性OA动物模型可分为经典的Hulth模型[17-18]、前交叉韧带横断模型[19]、半月板切除模型[20]、关节刻痕法模型[21]、切断臀肌法模型[22]、骨内高压模型[23]、卵巢切除术模型[24]等手术法造模模型及关节腔内注射模型[25]、关节制动法模型[26]等非手术法造模模型。

2.1 手术法造模模型

经典的Hulth模型、前交叉韧带横断模型、半月板切除模型等是对半月板、韧带等关节内单个部位或多个部位进行手术切除从而诱导OA发生。此类模型造模成功率高，可重复性高，适用于创伤后骨关节炎的研究；但手术创伤对关节损害大，且易引发术后感染导致炎症等。关节刻痕法模型则只是在关节股骨上刻痕，创伤较小且关节炎症轻微，适用于早期OA的研究，但此类模型造模周期稍长。切断臀肌法模型、骨内高压模型、卵巢切除术模型等的共同点是手术部位选择非关节组织、避免了关节的损伤。切断臀肌法模型是通过肌肉损伤造模，骨内高压模型通过结扎或切断某些静脉干扰关节的血液循坏进而造模，而卵巢切除术模型则是通过切除卵巢来模拟绝经后的骨关节炎。这三种模型分别适用于研究肌肉损伤、血液供应以及雌激素等因素对OA发生的影响，应用面窄，不适合广泛的OA相关研究。

2.2 非手术法造模模型

非手术法造模模型主要包括关节腔内注射模型、关节制动法模型两类。关节腔内注射模型是通过向关节腔内注射能够损害关节的药物，如木瓜蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、菲律宾菌素、碘醋酸盐、碘乙酸盐等进而诱发OA的发生。关节腔注射造模具有微创、易于操作的优点，但药物的剂量难以掌控易造成误差。关节制动法模型是采用固定或牵引的方式对动物的关节进行机械性制动从而造成关节损伤。这种造模方式同样避免了手术创伤，且模型与人类缺乏运动所致OA有一定相似性；但目前缺乏完美的固定设施及材料且制动操作复杂，难以控制。此外，寒冷刺激、饮食诱导、运动性损伤等方式也可以诱发OA模型，此类模型也属于非手术法造模模型，但模型成因较为特殊、造模耗时长且应用不广泛[16]。

3 转基因OA动物模型

转基因OA动物模型指利用转基因技术结合基因编辑技术等将外源基因插入动物基因组或对动物自身基因进行突变、敲除等改变而导致OA发生的动物。已报道的转基因OA动物模型几乎全是利用小鼠造模[27]。根据不同的基因改造策略及改造结果，可将转基因OA小鼠模型分为三类：基因突变小鼠模型、全身性敲除小鼠模型以及条件性敲除小鼠模型。下面对不同转基因OA小鼠模型逐一进行介绍。

3.1 基因突变小鼠模型

Col2a1点突变转基因小鼠：Arita等[28]向FVB/N小鼠外源导入了突变(第519位精氨酸更替为半胱氨酸)的人类Col2a1基因从而构建了Col2a1基因点突变的转基因小鼠。这一突变策略模拟了临床家族性OA病人中Col2a1基因第519位精氨酸更替为半胱氨酸的这一突变[29]。Col2a1基因点突变转基因小鼠呈现骨骼发育延迟、II型胶原纤维密度减少，软骨发育异常等OA样表型[28]。

3.2 全身性基因敲除小鼠模型

3.2.1Blotchy转基因小鼠模型：早在1977年，Silberberg等[30]报道了Blotchy转基因小鼠模型，其X染色体上“Mottled”基因位点携带了导致胶原蛋白和弹性蛋白交联缺陷的基因[31-32]。他们发现Blotchy转基因半合子雄性小鼠除了发生肺气肿和主动脉瘤，还有典型的骨关节炎表征。1996年，Glasson等[33]利用同一小鼠模型的杂合子雌性小鼠展开研究，发现Blotchy雌鼠也呈现软骨损伤、蛋白聚糖严重缺失等OA表型。

3.2.2Col2a1相关的转基因小鼠：1992年，Metsaranta等[34]在B6D2F1小鼠中敲除Ⅱ型胶原基因的第7外显子，小鼠出生即死亡，关节软骨基质及胶原纤维减少，生长板结构紊乱、四肢、胸腔、颅骨等畸形。

1993年，Helminen等[35]发现Col2a1缺陷基因转基因小鼠也具有OA特征，Vandenberg等[36]向FVB/N小鼠外源导入了一段删除12个外显子的人COL2A1基因，这一缺陷基因编码一条缺失291个氨基酸的短肽链，它与小鼠内源性表达的全长肽链同时存在导致前胶原纤维无法形成稳定的结构进而被降解，从而导致Col2a1的全身删除。Col2a1缺陷基因转基因小鼠的表型呈现多样化：15%的小鼠发生腭裂后死亡；存活的小鼠在1 d到3月龄间发生不同程度的软骨基质胶原纤维变少、软骨细胞粗面内质网扩张等软骨发育异常现象，小鼠的质量及骨密度都减少；15月龄小鼠则发生典型的OA样软骨退行性病变[35]。

1995年，Li等[37]通过破坏Col2a1基因的第35外显子构建了Col2a1基因敲除的转基因小鼠模型。纯合小鼠出生前后致死，关节软骨细胞缺乏细胞外基质及胶原纤维，长骨缺失软骨内骨及骨骺生长板，但颅骨及肋骨正常。利用这一模型，Lapvetelainen等[38]进一步发现杂合小鼠更易发生膝关节骨关节炎。

3.2.3Col9al敲除小鼠:1994年，Fassler等[39]构建了Col9al基因敲除小鼠。IX型胶原是由α1、α2及α3三条肽链组成的三聚体，研究者们通过破环α1链的第8外显子得到Col9al基因敲除小鼠，小鼠发生人OA样退行性关节疾病[39]。随后，Kimura等[40]发现这一突变小鼠的脊椎也发生类似的退行性病变。Hu等[41]进一步发现Col9al基因敲除小鼠的膝关节及颞下颌关节也发生年龄依赖性的OA样病变。Col9al基因敲除小鼠3月龄时开始出现表型，6月龄小鼠关节软骨蛋白聚糖及IX型胶原降解严重，基质金属蛋白酶及盘状蛋白域受体2表达增加，此外股骨和胫骨的关节软骨力学结构特性及渗透性也发生改变。

3.2.4Del1敲除小鼠:2000年，Saamanen等[42]报道了Del1位点插入6个拷贝的突变Col2转基因的小鼠模型，Del1杂合小鼠发生软骨关节退化及侵蚀、半月板退化、关节结构矿化、囊肿、软骨下骨暴露等OA样病变。

2016年，王振等[43]发现Del1基因敲除小鼠更易引发严重的OA。利用的小鼠模型是Hidai等[44]于1998年构建的Del1-LacZ敲入小鼠，其构建策略是在小鼠的Del1位点插入LacZ基因，导致Del1遭到破坏而发生敲除以及LacZ的表达。这一小鼠的骨骼密度和形态正常，耳朵和膝关节的软骨变薄，在损伤压力下更易导致OA的发生[43]。

3.2.5双链蛋白多糖/纤调蛋白聚糖敲除小鼠:2003年，Young等[45]发现双链蛋白多糖基因敲除小鼠、纤调蛋白聚糖基因敲除小鼠以及双糖链蛋白多糖/纤调蛋白聚糖的双基因敲除小鼠都会发生早发性OA，双基因敲除小鼠的OA表型发生更早且更严重。

3.3 条件性基因敲除小鼠模型

3.3.1β-catenin条件性敲除小鼠：2009年，朱梅等[46]特异性敲除关节软骨细胞β-catenin的第3外显子的一个拷贝，导致小鼠发生人OA样表型。研究者们将Col2a1-CreERT2转基因小鼠[47-48]与β-cateninfx(Ex3)/fx(Ex3)基因打靶小鼠[49]交配得到Col2a1-CreERT2;β-cateninfx(Ex3)/wt小鼠，经tamoxifen诱导后β-catenin第3外显子被敲除。小鼠5月龄时关节软骨减少，8月龄时观察到关节表面纤维性颤动、裂陷、软骨骨赘形成等现象。同时，小鼠关节软骨中Aggrecan、Mmp-9、Mmp-13、Alp、Oc、ColX等多种软骨细胞标志物以及Bmp2的表达都显著上升[46]。

3.3.2EFNB2条件性敲除小鼠：2016年，Valverde-Franco等[50]将Col2a1-Cre转基因小鼠与EFNB2fx/fx基因打靶小鼠交配得到软骨特异性EFNB2纯合敲除小鼠(Col2a1-Cre;EFNB2fx/fx)，小鼠软骨细胞EFNB2的第1外显子被敲除。研究者们分析EFNB2敲除小鼠发现：刚出生时小鼠生长板X型胶原蛋白表达增加、肥大区紊乱、矿化减少；15日龄小鼠软骨-骨连接处VEGF和TRAP的表达显著下降、骨体积和骨小梁厚度减少导致第二骨化中心形成延迟；21日龄及8周龄小鼠骨密度下降；12月龄小鼠膝关节和髋关节均表现出OA的表型。

3.3.3DOT1L条件性敲除小鼠：2017年，Monteagudo等[51]发现DOT1L具有维持软骨组织稳态及预防OA发生的作用。研究者们抑制DOT1L活性后野生小鼠发生骨关节炎，利用软骨细胞表达的Col2a1-Cre敲除DOT1L第2外显子后，小鼠关节软骨X型胶原和MMP13表达增加，关节软骨稳态受到影响。同时，小鼠还出现骨骼生长停滞，生长板前肥大区发生紊乱等表型。

3.3.4Pten条件性敲除小鼠：2019年，谢婧等[52]发现关节软骨中持续激活Akt信号导致小鼠发生骨关节炎。研究中同时使用组成型Col2a1-Cre转基因小鼠及诱导型Col2a1-CreERT2转基因小鼠分别与第4、5外显子被锚定的Ptenfl/fl小鼠交配得到软骨细胞特异性Pten敲除小鼠。Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠5月龄时蛋白聚糖减少，关节软骨厚度减少、关节软骨结构破损；8月龄时关节表面变粗糙并发生侵蚀；10月龄时小鼠软骨严重缺损；随着鼠龄增加，关节软骨缺损严重，软骨下骨和滑膜皆发生病变并形成骨赘。为排除Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠中生长板缺损造成的影响，研究者们进一步在Col2a1-CreERT2；Ptenfl/fl小鼠中进行分析，发现诱导性Ptenfl/fl敲除小鼠8月龄也出现了明显的OA的表型。

目前转基因OA动物模型多为全身性的突变或敲除小鼠，条件性基因敲除小鼠模型仍然缺乏。全身性的突变或敲除的OA小鼠模型除了有部分类似OA的病理表型外，多数还同时发生其他器官或组织的缺陷，这对研究OA的治病机制或是治疗方法等具有一定的影响。条件性基因敲除小鼠模型在软骨细胞中特异性敲除特定基因进而研究其功能，这对探索OA发生发展的过程及机制有很好的促进作用，但目前这类模型的数量有限，OA的致病机理及治疗机制等相关研究仍有很大的空白，研制新的条件性转基因OA小鼠模型具有重要意义。

4 小结

人类OA的发病原因复杂，与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素等都有重要联系[53-54]。OA动物模型的应用及研究对探究人类OA的致病机理、预防及治疗等具有不可替代的作用。任何动物模型的研制都需要符合相似性、重复性、可靠性、适用性和可控性、易行性和经济性、符合动物实验伦理和3Rs理论等多项原则。理想的OA模型最重要的标准是能够最大程度模拟人类OA的发生发展过程，即组织病理、细胞状态、相关信号通路及分子标志物等多方面的变化都与人类OA相一致。此外，还需要符合周期短、费用低、操作便利、表型稳定可重复、动物福利伦理等多种要求。然而，目前大部分OA动物模型只能模拟临床OA的部分症状，不同的OA动物模型都有自己独特的优势，也存在局限性。自发性OA动物模型避免了人为损伤，但造模周期长、费用高。诱发性OA动物模型中，手术法会对动物造成创伤，稳定性难以维持；非手术法药物种类及剂量、操作方式及时间都难以控制；多数诱发性OA动物模型适用领域都比较窄[55]。相对自发性诱发性造模来说，转基因造模不仅能够避免手术创伤，减轻模型动物的痛苦，还能弥补其他方法造模的不稳定性，具有其他造模方法无法比拟的特点和优势。目前多种转基因OA模型被成功研制并在OA的致病机理、药物筛选、预防及治疗等相关研究发挥作用，也是未来OA模型研制的主要方向。

除了运用单一的造模方法，很多OA的相关研究中结合使用了多种造模方法，如多部位手术诱发造模[56]、转基因模型结合诱发性干预[43]、多基因敲除造模等[45]。鉴于目前的OA动物模型无法模拟人类OA的所有特征，研究者需要根据自己的研究领域及研究目的选择合适的造模策略，转基因OA模型因其独特的优越性而具备很重要的发展潜力。此外，为最大程度模拟人类临床OA病理特征，OA动物模型的研制必然走向以转基因造模为主、同时结合其他造模方法综合运用的趋势。