绿原酸治疗口腔溃疡的动物实验研究

刘锦婷 张 泽 林 静 李胤宏 罗廷炎 陈巧妮 顾 瑜，▲ 白国辉

1.遵义医科大学珠海校区口腔医学系，广东珠海 519041；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州遵义 563000

[关键字] 口腔溃疡；绿原酸；肿瘤坏死因子α；超氧化物歧化酶

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是最常见的口腔黏膜病，患病率可高达50%。ROU表现为圆形或椭圆形溃疡，具有“黄、红、凹、痛”的临床特点。本病具有自限性、复发性、周期性的特征，发作时疼痛明显，影响进食、言语等日常行为。目前病因和发病机制尚未明确，研究显示ROU的发生发展与病毒或细菌感染、自身免疫、营养缺乏、精神心理、遗传及免疫失调等有关。目前临床上一般以改善疼痛的对症治疗为主[1]，尚缺乏有效地根治方法。

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是奎尼酸与反式肉桂酸缩合而成的酯类化合物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，CGA便宜易得、绿色安全，并且具有抗氧化、抗菌、抗突变和抗癌变、降血脂和降血压、保护心血管和中枢神经、抑制糖尿病、抗紫外线和抗辐射、抗白血病、免疫调节、细胞保护、保肝、抗内毒素等多方面的药理作用[2-4]。研究发现，CGA可减少硫酸葡聚糖诱导的结肠黏膜损伤[5]。但尚未见其促进口腔溃疡的相关研究。本课题通过构建大鼠口腔溃疡动物模型，予以不同浓度CGA处理口腔溃疡后，观察CGA对大鼠口腔溃疡的疗效，及对细胞炎症因子及氧化应激因子的影响，为CGA治疗ROU的实验研究和临床应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠72只，雌性，体重240～260g，购于湖南长沙实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（湘）2019-0014。实验开始前适应性饲养3d，饲养于遵义医科大学实验动物中心［室温（22±1）℃，相对湿度30%～60%，12h光照/12h黑暗］，大鼠自由摄食和饮水。

1.1.2 药品及试剂 绿原酸（批号：K200V08，酷尔化学科技有限公司）；肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒（批号：20191101，南京建成生物工程研究所），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20191031，南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠ROU模型 用10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉大鼠后，将浸透饱和NaOH溶液的滤纸片（3mm×3mm）分别置于大鼠左右两侧颊黏膜20s，所有大鼠均在同一部位做相同处理。24h后大鼠口腔黏膜出现明显的溃疡面，肉眼观察可见溃疡中央凹陷，上覆黄白色假膜，周围充血水肿，显示建模成功。

1.2.2 分组及给药 建模成功后，将72只SD大鼠随机分为四组，每组18只，分为对照组及高、中、低浓度组。其中对照组左右两侧溃疡面不予以任何处理；高、中、低浓度组给药浓度分别为10.0、5.0、2.5mg/mL绿原酸溶液。建模后第2天开始给药，每日用棉签吸附20μL相应药物作用于左右两侧溃疡面1min，早晚各1次，给药后30min禁食禁水。

1.3 样本采集

分别于首次给药后第3、5、7天每组随机选出6只大鼠，麻醉后使用真空采血管经腹主动脉采集血液样本，高速离心后将血清-80℃冰箱保存备用。然后处死大鼠，完整取下溃疡黏膜及肌层。

1.4 观察指标

1.4.1 溃疡面积的测定 用游标卡尺测量0、3、5、7d的大鼠口腔溃疡最大横径（d1）和最大纵径（d2），单位为mm，因溃疡多为椭圆形，所以可参照椭圆面积计算公式计算溃疡面积（溃疡面积=π×d1×d2×1/4，π取值3.14），单位为mm2。

1.4.2 病理学观察 将取下的第3、5、7天的溃疡组织于4%多聚甲醛固定24h后，依次经过脱水，包埋，切片，HE染色，封片后制作成切片，光镜下观察组织病理学的变化。

1.4.3 血清中TNF-α、SOD的测定 将采集的血清样本，于4℃静置2h后，4℃，3000r/min离心10min，取上清按照试剂盒说明书使用黄嘌呤氧化酶法检测SOD水平。采用ELISA法测定四组血清TNF-α水平，操作过程严格按照说明书进行。检测步骤为2倍倍比稀释标准品、加标准品、加样本和二抗、加酶温育30min，配洗液并洗板，避光显色10min，加终止液。检测因子在加入终止液的5～30min内均在450nm处检测OD值，最后根据标准曲线计算血清中细胞因子的含量。

1.5 统计学分析

应用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绿原酸对大鼠口腔溃疡变化的影响

实验第3天，与对照组比较，高浓度组溃疡明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）；第5天，高浓度组和中浓度组溃疡与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天，高、中、低浓度组的溃疡面积与对照组比较均明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 绿原酸对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响

给药第3天，对照组溃疡表面仍可见覆盖较厚的黄白色假膜，低浓度组溃疡表面可见部分假膜覆盖，而中高浓度组溃疡表面假膜基本脱落；对照组镜下观可见黏膜上皮溶解、脱落，固有层中胶原纤维破坏消失，有大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主。与对照组比较，各浓度组的固有层炎症细胞明显减少，毛细血管增生明显。第5天，对照组仍有少量炎症细胞浸润，而各浓度给药的上皮修复基本完整。第7天，各浓度组溃疡范围不明显，基本痊愈，镜下各组上皮修复基本完成。见图2。

图1 绿原酸对大鼠的溃疡面积的影响

图2 绿原酸对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响（HE×200）

2.3 绿原酸对大鼠血清中SOD活性的影响

首次给药后第3、5、7天，低、中、高浓度组的SOD活性与对照组比较均有明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 四组口腔溃疡大鼠血清SOD水平比较（±s，IU/L）

表1 四组口腔溃疡大鼠血清SOD水平比较（±s，IU/L）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 n 给药第3天 给药第5天 给药第7天对照组 6 94.55±1.07 94.70±1.99 100.33±0.58低浓度组 6 98.65±3.59* 101.60±1.80* 103.30±0.98*中浓度组 6 99.66±0.65* 103.90±2.23* 105.40±1.46*高浓度组 6 101.10±1.28* 104.50±1.31* 108.20±2.33*F 11.812 35.101 30.534 P 0.003 0.000 0.000

2.4 绿原酸对大鼠血清中TNF-α水平的影响

首次给药后第3、5、7天，低、中、高浓度组的TNF-α活性均明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 四组口腔溃疡大鼠血清TNF-α水平比较（±s，ng/dL）

表2 四组口腔溃疡大鼠血清TNF-α水平比较（±s，ng/dL）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 n 给药第3天 给药第5天 给药第7天对照组 6 24.14±0.96 16.40±1.11 9.26±0.93绿原酸组 6 16.32±0.43* 9.86±1.40* 4.59±0.85*绿原酸组 6 14.42±0.89* 9.19±1.09* 2.08±0.87*绿原酸组 6 8.16±1.33* 7.67±0.88* 1.37±0.63*F 284.105 69.403 111.529 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

ROU是口腔科就诊中常见且多发的口腔黏膜疾病，临床上尚无理想的根治方法，目前主要以消炎止痛等对症治疗为主，因此寻找对该病治疗有效的药物成为近年研究热点。目前中药在治疗口腔溃疡的方面上取得了不错的效果，研究表明导赤散加金因肽能下调血清VEGF，TNF-α水平，促进口腔溃疡愈合，减少溃疡复发，疗效可靠[6]。CGA是一种从双子叶植物中分离得到的酚类，也是许多中草药及中药复方制剂的主要活性成分，在杜仲、金银花、向日葵、可可树中含量较高，具有抗炎、抗氧化和促愈合的作用[7-8]。本实验结果显示，在ROU大鼠模型中，与对照组比较，高、中、低浓度CGA处理后的口腔的溃疡面积均减小。其中，高浓度组第3天起溃疡明显减小，与对照组比较差异有统计学意义；中浓度组第5天起，与对照组比较差异有统计学意义，第7天，低浓度组与对照组比较差异有统计学意义。以上结果初步证实CGA能明显促进口腔溃疡愈合，且与浓度相关，一定剂量的前提下浓度越高愈合效果越好。

近年来，炎症因子与ROU的关系成为国内外学者关注的焦点。TNF-α是炎症发生过程中的关键细胞因子，通过对内皮细胞黏附功能的影响及诱导中性粒细胞趋化来启动炎症反应[9-11]。王艺衡等[12]提出TNF-α可诱导包括自身在内的多种细胞因子活化，促使口腔黏膜上皮淋巴细胞的增殖、分化和移行，这一过程释放大量特异性或非特异性炎症因子，引起局部免疫破坏，故其是评判口腔溃疡严重程度的重要指标。周英等[13]发现，CGA可以通过抑制TNF-α、IL-6等细胞炎症因子和花生四烯酸代谢途径的关键酶COX-2的活性来抑制炎症反应发生。本研究显示，相对于对照组，不同浓度实验组中固有层炎症细胞明显减少，TNF-α水平明显降低，表明CGA可能通过抑制炎症因子水平从而加速溃疡黏膜的修复。

口腔溃疡的发生发展还可能与氧自由基的增多相关[14]。杨剀舟[15]证实CGA具有良好的抗氧化活性，能够清除多种化学类自由基和活性氧自由基。本实验显示，与对照组比较，各实验组SOD活性明显升高。徐建升[16]发现SOD可以通过清除体内的自由基进而保护细胞，SOD是抗氧化酶体系的重要组成成分，其水平的高低能够体现口腔溃疡的愈合速率，表明CGA可能通过增高SOD活性从而加速溃疡黏膜的修复。

综上所述，CGA可有效地降低ROU大鼠血清中TNF-α水平，升高SOD水平，从而达到治疗ROU的作用，疗效显著，但远期疗效以及治疗最佳浓度的确定还有待进一步研究。