肺心宁汤对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂1水平的影响※

马志娟 舒 亮 杨 爽 黄 燕

(内蒙古自治区中医医院肺病科，内蒙古 呼和浩特 010020)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全气流受限为特征，以慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难为主要临床表现的呼吸系统常见病，气道重塑是COPD气流受限的根本原因[1]。目前，虽然COPD气道重塑的确切发病机制尚未明了，但已有研究表明其发生发展与炎症反应、细胞外基质合成与降解失衡、氧化应激、细胞凋亡密切相关，其中细胞外基质合成与降解失衡是导致COPD气道重塑的重要环节之一[2]。肺心宁汤具有清热化痰、宽中散结的功效，是我们临床治疗肺系疾病的经验方[3]，先前研究表明其对于COPD模型大鼠具有良好的治疗效果，可以减轻大鼠气道炎症，改善血管内皮功能[4]，但肺心宁汤是否对COPD气道重塑也有改善作用尚未得到证实。我们拟通过观察肺心宁汤对COPD模型大鼠基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)水平变化影响，探讨肺心宁汤对COPD气道重塑的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级Wistar雄性大鼠60只，体质量150～160 g，饲养于内蒙古自治区中医医院动物实验中心，室温20～23 ℃，湿度50%～60%，由内蒙古大学实验动物中心提供，许可证号：SAXK(蒙)2016-0001。

1.2 实验药品及物品 肺心宁汤(药物组成：黄连3 g，杏仁6 g，瓜蒌15 g，泽泻6 g，半夏 9 g，茯苓9 g，枳实6 g，陈皮6 g，炙甘草3 g，由内蒙古自治区中医医院制剂室负责制成汤剂，生药含量0.525 g/mL)；醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021207)；脂多糖(美国SIGMA公司)；红梅牌香烟[红塔烟草(集团)有限责任公司，烤烟型]；自制有机玻璃染毒箱(长×宽×高：100 cm×50 cm×50 cm，在箱体两侧均有直径约1.5 cm的换气孔)。

1.3 主要试剂及仪器 MMP-9酶联免疫吸附(ELISA)法检测试剂盒及TIMP-1 ELISA检测试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)；通用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)试剂盒(M-MLV)及内参抗体(β-actin)(美国Promega公司)；Trizol总RNA抽提试剂(美国Invitrogen公司)；Real-Time PCR仪(瑞士Roche公司)；UItra SYBR Mixture(美国Invitrogen公司)；CT15RE台式高速冷冻离心机(日本日立公司)；JT-12电脑生物组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；RM 2016轮转式切片机(德国Leica公司)；BX53生物显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及模型制备 将60只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、醋酸泼尼松组、肺心宁汤低剂量组、肺心宁汤中剂量组及肺心宁汤高剂量组，每组10只。除正常组外，其余5组均参照文献[5]中COPD的造模方法，采用烟熏加气道内滴入脂多糖制作COPD模型，造模周期为90 d。

1.4.2 COPD模型评价 造模结束后，各组均随机抽取2只大鼠处死，取大鼠肺组织进行苏木精-伊红(HE)染色做成病理切片后在生物显微镜下观察，可见肺泡壁变薄、断裂，肺泡腔扩大，部分融合成肺大泡，肺间隔增厚，大量炎性细胞浸润，说明COPD大鼠模型制作成功。见封3，图1。

1.4.3 给药方法 正常组及模型组按6.3 mL/kg予蒸馏水灌胃，醋酸泼尼松组按0.027 g/kg予醋酸泼尼松片药液灌胃，肺心宁汤低、中、高剂量组分别按3.3、6.6、13.2 mL/kg予肺心宁汤药液灌胃，每日1次，连续灌胃28 d。

1.4.4 取材 各组大鼠末次灌胃24 h后腹腔麻醉并处死。剖开腹部，通过腹主动脉采血适量，静置30 min，以3 000 r/min离心5 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待测。打开大鼠胸腔，剥离肺组织，用0.9%氯化钠注射液冲洗干净后将肺组织剪为2部分，一部分放入冻存管，置于-80 ℃冰箱冷冻保存，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 肺组织病理形态学变化 将采用多聚甲醛溶液固定的肺组织用梯度酒精脱水、浸蜡、包埋，制成石蜡块，切片，采用HE染色法进行染色，最后在生物显微镜下观察肺组织病理形态学变化。

1.5.2 血清MMP-9及TIMP-1检测 将冷冻保存的血清标本常温解冻后置于超净工作台上，均采用ELISA法对血清MMP-9及TIMP-1水平进行检测，相关操作按试剂盒说明书进行。

1.5.3 肺组织MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA检测 采用Real-Time PCR法检测肺组织中MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表达情况。首先取冻存的肺组织，放入研钵中加入液氮进行研磨，磨成粉末状后，采用Trizol试剂盒从肺组织中提取总RNA。然后所得总RNA样本根据45 ℃，55 min，95 ℃，5 min条件，在Real-Time PCR仪中进行逆转录反应以得到对应的cDNA。最后在Real-Time PCR仪上按照如下反应程序进行扩增反应：预变性，95 ℃，10 min；变性，95 ℃，15 s；退火/延伸，60 ℃，1 min，40个循环。以β-actin作为内参照。采用2-△△CT法分析样品间的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠灌胃后肺组织形态结构及病理变化 正常组大鼠肺泡壁结构完整，肺泡腔无扩大，肺泡腔内无明显渗出，肺间隔未见增厚，无明显炎性细胞浸润。模型组大鼠肺泡腔扩大，肺泡壁变薄、断裂，部分融合成肺大泡，肺间隔增厚，大量炎性细胞浸润。醋酸泼尼松组及肺心宁汤低、中、高剂量组在灌胃干预治疗后，大鼠肺组织出现不同程度的肺泡腔扩大，炎性细胞浸润，但较模型组病理程度减轻，其中肺心宁汤高剂量组肺泡扩张较少，肺泡结构大致正常，少量炎性细胞浸润，其余3组治疗效果均差于肺心宁汤高剂量组。见封3，图2。

2.2 各组大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比较 见表2。

表2 各组大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比较

由表2可见，与正常组比较，模型组大鼠血清MMP-9水平明显升高(P<0.05)，TIMP-1水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较，醋酸泼尼松组及肺心宁汤低、中、高剂量组血清MMP-9水平均明显降低(P<0.05)，TIMP-1水平均明显升高(P<0.05)。肺心宁汤各剂量组组间比较，肺心宁汤中、高剂量组血清MMP-9水平均明显低于肺心宁汤低剂量组(P<0.05)，TIMP-1水平均明显高于肺心宁汤低剂量组(P<0.05)，且肺心宁汤高剂量组血清MMP-9及TIMP-1水平改善均优于肺心宁汤中剂量组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠灌胃后肺组织MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相对表达情况比较 见表3。

表3 各组大鼠灌胃后肺组织MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相对表达情况比较

由表3可见，与正常组比较，模型组大鼠肺组织MMP-9 mRNA表达明显升高(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较，醋酸泼尼松组及肺心宁汤低、中、高剂量组肺组织MMP-9 mRNA表达均明显降低(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表达均明显升高(P<0.05)。肺心宁汤各剂量组组间比较，肺心宁汤中、高剂量组肺组织MMP-9 mRNA表达均明显低于肺心宁汤低剂量组(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表达均明显高于肺心宁汤低剂量组(P<0.05)，且肺心宁汤高剂量组肺组织MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达改善均优于肺心宁汤中剂量组(P<0.05)。

3 讨 论

气道重塑是以气道慢性炎症为发生基础，是气道炎症慢性化发展的必然结果，包括基底膜的假性增厚、细胞外基质的改变、平滑肌增生肥大等，研究表明COPD患者支气管壁较正常人明显增厚，并发生有气道组织的结构变化[6-7]。COPD患者发生气道重塑与细胞外基质的合成与降解失衡关系密切，正常情况下细胞外基质的合成与降解维持在一个动态平衡状态，对保护组织损伤起着关键性的作用，一旦平衡失调，细胞外基质过度的合成或降解，都会影响到气体交换，进而影响气道结构，加重气道纤维化，最终导致气道阻塞，引起气流受限[8-9]。因此，维持细胞外基质合成与降解平衡对延缓COPD病情的发生、发展具有重要意义。MMP-9及TIMP-1是干预细胞外基质合成与降解的关键因子，其水平变化常常作为反映COPD气道重塑过程中炎症程度与气道修复的关键指标[10-12]。MMP-9是一种蛋白水解酶，作为一种降解酶其不仅可以降解气道及肺组织细胞外基质成分，使肺泡腔扩大，肺泡弹性回缩能力减弱，从而导致气流滞留，还可介导炎症细胞聚集，破坏上皮和内皮结构，加重炎性反应，且其活性程度与COPD呼吸受限程度呈正比[13-14]。TIMP-1是MMP-9特异性的抑制酶，其可与MMP-9催化位点结合形成聚合物，通过降低MMP-9的活性来抑制细胞外基质的降解，减少降解产物在黏膜下层聚集，此外TIMP-1还具有促进成纤维细胞增殖和胶原合成的生长因子样作用，促进组织修复[15-16]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠灌胃后血清MMP-9水平及肺组织MMP-9 mRNA表达均明显升高(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺组织TIMP-1 mRNA表达均明显降低(P<0.05)。说明造模后模型组发生气道重塑。

COPD属中医学喘证、咳嗽、肺胀等范畴。《灵枢·五阅五使》言：“肺病者，喘息鼻张。”《灵枢·胀论》言：“肺胀者，虚满而喘咳。”《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治》言：“咳而上气，此为肺胀，其人喘，目如脱状。”中医学认为，COPD发病主要与肺、脾二脏相关，脾为生痰之源，肺为贮痰之器，外邪犯肺，肺气失宣，又脾气不足，运化失司，聚湿为痰，郁久化热，痰液熏蒸，痰火交阻于肺，肺失宣降，上逆为喘。《太平圣惠方》中记载：“邪气与正气相搏，不得宣通，胸中痞塞，痰饮留滞，喘息短气，昼夜常嗽，不得睡卧也。”我们所用肺心宁汤是由经典名方小陷胸汤化裁而来，方中瓜蒌清热化痰，宽胸散结，以通胸膈之痹；黄连配伍半夏，寒热并用，辛开苦降，泄热除痞，化痰散结；陈皮、枳实燥湿化痰，行气健脾；茯苓淡渗利湿；杏仁宣肺平喘；泽泻健脾宁心，利水渗湿；甘草调和诸药。诸药合用，使痰热得以消散，肺气得以宣降，具有健脾燥湿、清热化痰、宣肺理气、宽中散结的功效。现代药理学研究表明，小陷胸汤合抵当汤可能通过降低肺纤维化大鼠细胞外基质含量而发挥治疗肺纤维化作用[17]；瓜蒌中的氨基酸能减少炎性分泌物的分泌，从而发挥抗炎的作用[18]；半夏中提取的总生物碱可延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，起到镇咳祛痰的作用[19]；陈皮中挥发油可扩张支气管，改善气流受限[20]。本研究结果显示，经过相应灌胃干预治疗后，与模型组比较，醋酸泼尼松组及肺心宁汤低、中、高剂量组血清MMP-9水平及肺组织MMP-9 mRNA表达均明显降低(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺组织TIMP-1 mRNA表达均明显升高(P<0.05)，且肺心宁汤高剂量组改善效果均优于肺心宁汤中、低剂量组(P<0.05)，说明肺心宁汤的治疗效果与醋酸泼尼松一致，并存在一定的量效关系。

综述所述，肺心宁汤对于COPD大鼠具有确切的治疗作用，其作用机制可能为降低血清MMP-9水平，升高TIMP-1水平，抑制肺组织MMP-9 mRNA表达，促进TIMP-1 mRNA表达，进而干预气道重塑过程，改善肺组织病理损伤，延缓病情进展，且其对COPD的改善作用与剂量呈正相关。