ABA对拟南芥AtHsfA1a在冷胁迫响应中生理指标的影响

姚丽媛，戴利利，陈子牛，2，郭丽红

(1．昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；2．云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214；3．昆明学院 研究生处，云南 昆明 650214)

近年来，植物激素脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为环境胁迫中的重要信号分子，其研究范围越来越深入广泛．研究[1-5]表明，植物在高温、低温、干旱、盐胁迫等逆境中体内ABA迅速积累而增强抗逆性．热激因子(Heat shock transcription factor，HSF)是真核生物中相对保守的一个转录因子家族[6]．作为逆境信号传导通路中的重要成员，它能直接启动下游抗逆境基因的表达，从而提高抗逆境的能力[7-10]．有资料显示：拟南芥热激因子HsfA6b作为ABA信号通路下游的一个正调节器，调节盐和干旱胁迫的响应，是耐热性建立所必需的[11]；小麦热激因子TaHsfC2a通过ABA介导的调控途径构建了耐热机制[12]；并且外源ABA能通过H2O2上调水稻叶片中热激因子OsHsfA4a和OsHsfA2a的表达[13]．尽管研究显示，在逆境中ABA能调控部分热激转录因子HSF的表达，但关于ABA与转录因子HSF如何从生理水平协同提高抗逆性的研究相对较少．众所周知，在自然界中植物往往通过自身的生理防御系统保护自己免受逆境的伤害．已知植物在逆境中会产生大量的活性氧(AOS)，活性氧会导致细胞膜系统的氧化损伤[14-16]．而植物细胞存在抗氧化酶系统，包括SOD(EC，1.15.11)，CAT(EC，1.11.1.6)，GR(EC，1.6.4.2)和APX(EC，1.11.1.7)，在逆境中它们的活性可得到不同程度的增强，能将活性氧控制在细胞可以忍耐的水平[17-23]．大量研究[2-5]发现，外源ABA在逆境中会提高抗氧化酶的活性而降低氧化胁迫的伤害．本课题组前期研究也发现，过量表达拟南芥热激因子AtHsfA1a植株中的抗氧化酶 SOD、CAT和APX活性会明显增强[17]而降低渗透胁迫．哪ABA与拟南芥热激因子AtHsfA1a是否会影响逆境生理指标存在协调效应，值得进一步研究．

为了研究外源ABA对拟南芥热激因子AtHsfA1a在低温响应中生理指标的影响，采用AtHsfA1a基因T-DNA插入的突变体及野生型的拟南芥幼苗为材料，在冷胁迫下分析AtHsfA1a突变体及野生型植株的逆境生理生化指标MDA、H2O2、SOD、CAT、GR和APX变化，以及拟南芥热激因子AtHsfA1a在响应热胁迫中ABA的生理调控作用，以期为进一步研究植物耐逆境机理奠定生理基础．

1 材料与方法

1.1 材料

采用拟南芥哥仑比亚种(Arabidopsis thaliana，Ecotype Columbia)的T-DNA插入AtHsfA1a基因突变型(SALK-068042，简称MT)为实验材料，以野生型(简称WT)为实验对照．实验材料购于美国生物资源中心ABRC．

1.2 方法

1.2.1 材料栽培及低温处理

两种基因型(MT和WT)种子依次用0.1%的HgCl2和体积分数为70%的乙醇进行灭菌处理，在无菌条件下播种于1/2MS固体培养基中，置于光照培养箱中，培养条件为：温度 22 ℃、光照 12 000 lx 16 h/d．取4周的拟南芥幼苗浸没在SIB Buffer(0.5 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L KH2PO4，1%蔗糖，pH6.0)中，低温 4 ℃ 处理 2 d．以 22 ℃ 为对照实验的处理温度．

1.2.2 MDA测定

取低温处理过的小苗 500 mg 在液氮中研碎，悬浮于 5 mL 10%的三氯乙酸中．采用TBA法对植物叶片的MDA进行测定，测定450，532，600 nm 波长下的吸光度值，根据C=6.45(A532-A600)-0.56A450计算MDA浓度[18]．

1.2.3 H2O2测定

取低温处理过的小苗 500 mg 在液氮中研碎，悬浮于 1.5 mL 100 mmol/L 磷酸盐缓冲液中(pH6.8)．H2O2浓度分析按照Gay and Gebicki 2000年的方法[19]．

1.2.4 抗氧化酶活性测定

1)酶的提取．取低温处理过的小苗 500 mg，加入 5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)，内含20%甘油，1 mmol/L ASA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L GSH及 5 mmol/L MgCl2，在冰上研磨后，提取液在4 ℃下，经过 20 000×g离心30 min，上清液用来测定酶活性．

2)酶活性测定．SOD活性的测定方法参照Zhang等[20]的方法，以加入邻苯三酚来启动反应，同时每 30 s 记录1次 319.5 nm 处的吸光值，共测 4 min；CAT活性的测定方法参照Aebi[21]的方法，在 240 nm 下测定；APX活性的测定方法参照Rao等[22]的方法，在 290 nm 下测定；GR的测定参照Knörzer等[23]方法，以基于NADPH的氧化作用在 340 nm 下的吸光度的减少来衡量；蛋白质含量的测定以牛血清蛋白为标准，采用Bradford[24]的方法．

2 实验结果

2.1 ABA对AtHsfA1a突变型幼苗在冷胁迫下MDA的影响

MDA是膜脂过氧化后最重要的产物之一，其浓度可以反映植物细胞膜遭受逆境伤害的程度．从图1可看出，在低温下不同基因型拟南芥幼苗中MDA浓度均升高，但突变型拟南芥(MT)MDA的浓度较野生型(WT)高，在加入外源ABA处理后，无论突变型还是野生型MDA的浓度都有所下降，但突变型下降幅度较小，表明外源ABA抑制MDA的形成与热激因子AtHsfA1a呈正相关，说明外源ABA和AtHsfA1a协同降低MDA浓度，从而降低低温对细胞膜伤害．

2.2 ABA对AtHsfA1a突变型幼苗在冷胁迫下H2O2的影响

过氧化氢(H2O2)作为一类重要的活性氧和信号分子，其浓度的高低可以有效衡量细胞的受伤程度．从图2可看出，在常温下2种基因型的H2O2浓度差异不大，而在低温胁迫下，突变型拟南芥所含的H2O2浓度升高较野生型明显，加入外源ABA处理后不同基因型在低温下拟南芥所含H2O2都有一定程度降低，但突变型拟南芥所含的H2O2浓度降低较野生型小，说明外源ABA在低温下对H2O2浓度影响与热激因子AtHsfA1a有关，在低温下外源ABA和AtHsfA1a协同降低了H2O2浓度，从而降低低温产生活性氧的伤害．

2.3 ABA对AtHsfA1a突变型幼苗在冷胁迫下抗氧化酶的影响

大量研究[17-23]发现，抗氧化酶系统活性的增强与提高植物的抗逆性密切相关．本研究发现，冷胁迫处理可以使突变型和野生型植株SOD，CAT，GR和APX的活性不同程度升高(图3)，野生型植株的抗氧化酶活性升高均明显大于突变型植株的抗氧化酶活性．外源ABA处理后对野生型植株的抗氧化酶活性升高影响较大，而对突变型植株的抗氧化酶活性影响较小(图3a，3b，3c，3d)，表明外源ABA提高抗氧化酶活性是与热激因子AtHsfA1a有协同效应，低温下外源ABA和AtHsfA1a协同提高抗氧化酶活性而降低活性氧对植物的伤害，从而提高植物的抗冷性．

3 结果与讨论

近年来，植物激素脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为环境胁迫中的重要信号分子，能调控一些热激转录因子的表达和活性[11-13]，但ABA调控热激转录因子后的生理生化过程尚有待于进一步地探讨．热激因子(Heat shock transcription factor，HSF)作为逆境信号传导通路中的重要成员，它能直接启动下游防御基因(如热激蛋白基因HSP、抗坏血酸过氧化物酶APX等)的转录表达，从而提高抗逆境的能力[6-9]．虽然，目前有研究[7-10]显示，逆境诱导拟南芥热激因子AtHsfA1a在防御反应中发挥重要作用[7-10]．然而，不清楚热激因子AtHsfA1a在逆境应答途径上游感应哪些逆境信号，而进一步鉴定热激因子响应逆境的本质与机理是研究的趋势．大量研究[14-16]表明，植物细胞在逆境中反应活性氧伤害程度的生理指标丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)等浓度会发生变化，而降低逆境伤害的抗氧化酶系统也会积极参与，SOD、CAT、GR和APX等作为抗氧化酶系统的重要成员，在逆境中通过活性的增加来执行降低活性氧的生理功能使植物细胞受伤程度降到最低，从而提高植物抗逆性．但植物逆境中ABA与热激因子AtHsfA1a协同对逆境生理指标的影响研究较少．

为了研究ABA对拟南芥热激因子AtHsfA1a在冷胁迫响应中生理指标的影响，本研究采用AtHsfA1a基因T-DNA插入的突变体及野生型的拟南芥幼苗为材料，在冷胁迫下分析ABA突变体及野生型植株的逆境生理生化指标MDA、H202、SOD、CAT、GR和APX变化，同时探讨拟南芥热激因子AtHsfA1a在响应冷胁迫中ABA的生理调控作用．结果发现，在低温下外源ABA和AtHsfA1a协同降低了MDA和H2O2浓度．进一步研究还发现，低温下外源ABA和AtHsfA1a协同提高抗氧化酶活性降低低温产生活性氧对细胞膜系统的伤害而提高植物的抗冷性．研究[25]发现，在逆境中抗氧化酶活性高低与抗氧化酶的基因表达密切相关．此外，本项目申请者[26]也研究了在热胁迫下AtHsfA1a对APX的表达调控作用．研究[11-13]显示，在逆境中ABA能调控部分热激转录因子HSF的表达，但关于ABA与转录因子HSF如何从生理水平协同提高抗逆性研究较少，抗氧化酶基因的表达是否受 ABA和AtHsfA1a协同调控尚需进一步证实．