腰果叶多酚超声波辅助提取工艺及其抗氧化能力测定

王彦阳，张中润，郑晓瑞，高燕

（1.江门职业技术学院，广东江门529090；2.广东省绿色高性能新材料研发工程技术研究中心，广东江门529090；3.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州571737；4.广东省农科院植物保护研究所，广东广州510640）

腰果（Anacardium occidentale L.）原产巴西东北部地区，在我国已有80 多年的引种栽培历史，我国海南西南和东南部，云南西双版纳都有引种栽培，是我国热带地区经济价值高、用途十分广泛的珍贵植物[1]。腰果具有非常高的营养药用和保健价值[2]，腰果酸对乳腺癌、宫颈癌有治疗效果，可从食用的腰果树果中分离出来，长期食用腰果果托或果汁可以控制肿瘤的生长，腰果中含有的脂肪有很好的软化血管作用，对保护血管、防治心血管疾病大有益处[3]，有研究显示浓缩腰果蛋白可作为营养添加剂添加入食品中[4]。目前有关腰果的研究集中在腰果蛋白的提取及其特性[5-9]、腰果脂肪提取工艺及腰果加工的报道[10-13]，而对腰果多酚研究较少。响应面分析因其直观地反映了各影响因素情况，效果优于单因素试验[14]。本研究基于响应面法，对超声波提取腰果叶多酚进行了工艺条件优化，同时对腰果多酚进行了抗氧化性效应研究，为进一步研究腰果叶多酚提供依据，使腰果得到进一步开发和利用。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

腰果叶：海南省东方市新龙镇腰果园；没食子酸（分析纯）：上海研深实业有限公司；福林酚试剂（分析纯）：美国 Sigma 公司；DPPH、抗坏血酸、ABTS、FeCl3、K3[Fe（CN）6]、二丁基羟基甲（butylated hydroxytoluene，BHT）、C2HCl3O2、无水乙醇（均为分析纯）：东莞市万信精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

XO-5200DTS 超声波清洗仪：上海金鹏分析仪器有限公司；LGJ-10 冷冻干燥机：河南兄弟仪器设备有限公司；Wo-600A 微型高速粉碎机：山东百百顺仪器设备有限公司；E80 精细电子天平：天津市德安特传感技术有限公司；MS2200E 数字超声波清洗仪：上海遂欧仪器有限公司；Hh2004 超静离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；R-1300D 旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 多酚标准曲线的制作

以没食子酸为标准品进行标准曲线绘制，参照Folin-Ciocalteu 法略有修改[15]。用少量蒸馏水溶解并定容0.50 g 没食子酸至100 mL 得对照品溶液。取对照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于 8 个 50 mL容量瓶中定容。取上述溶液各0.5 mL 与1.25 mL 福林酚试剂摇匀后静置反应1 min，加入3.75 mL20%无水碳酸钠溶液，定容至25 mL，30 ℃下静置1.5 h 后测定其在765 nm 处的吸光度。

1.3.2 腰果叶多酚含量提取及测定

一定体积分数溶剂下，按一定温度及超声波处理时间萃取腰果叶粉末1.0 g 后得到粗提液。将粗提液5 000 r/min 离心5 min 后取上清液，经旋转蒸发器去除乙醇后用蒸馏水定容至100 mL 得腰果叶多酚提取液，4 ℃避光保存。取25 mL 腰果叶多酚提取液定容至50 mL，测定多酚质量浓度，计算公式如下：

式中：W 为腰果叶多酚的提取率，%；M1为提取的腰果叶多酚的质量，g；M2为腰果叶的质量，g。

1.3.3 单因素试验

1）丙酮体积分数对腰果叶多酚提取率的影响：固定提取多酚时间为20 min，提取多酚温度为30 ℃，料液比为 1 ∶20（g/mL），考察丙酮体积分数为 25%、35%、45%、55%、65%、75%对腰果叶多酚提取率的影响。

2）提取温度对腰果叶多酚提取率的影响：固定提取多酚时间为20 min，丙酮体积分数为50%，料液比为 1 ∶20（g/mL），考察温度 30、40、50、60、70、80 ℃对腰果叶多酚提取率的影响。

3）超声波处理时间对腰果叶多酚提取率的影响：固定提取多酚温度为30 ℃，丙酮体积分数为50%，料液比为 1 ∶20（g/mL），考察超声波处理时间 30、50、70、90、110、130 min 对腰果叶多酚提取率的影响。

4）料液比对腰果多酚提取率的影响：固定提取多酚时间为20 min，提取多酚温度为30 ℃，丙酮体积分数为 50%，考察料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）对腰果叶多酚提取率的影响。

1.3.4 Box－Behnken 试验设计

选取丙酮体积分数（A）、提取温度（B）、超声波处理时间（C）3 个因素，分别考察其单独作用时对腰果叶多酚提取率的影响。在单因素试验的基础上，每个因素选取3 个对多酚提取率影响较大的水平，利用Design－Expert8.0 软件建立因素和水平均为3 的响应面分析法，根据Box-Benhnken 模型，以丙酮体积分数（A）、提取温度（B）、超声波处理时间（C）为自变量，腰果叶多酚提取率为响应值（Y）。正交试验设计表见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Three factors and three levels of test design

1.3.5 腰果叶多酚抗氧化效应

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的测定

将腰果多酚提取液用蒸馏水稀释至不同浓度，取5.0 mL 与 5.0 mLDPPH（1 mmol/L）溶液混合后避光静置 30 min，于 517 nm 处测定吸光值（n1）[16-17]。同时测定5.0 mL 蒸馏水与 5.0 mLDPPH 溶液、5.0 mL 相应浓度提取液与5.0 mL 无水乙醇的517 nm 光吸收值（用n2、n3表示）。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（n1-n3）/n2]×100

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的测定

将 5.0 mL 7 mmol/L 的 ABTS+溶液与 88.0 μL 140 mmol/L 的 K2S2O8混合后于避光反应 12 h～16 h 得到ABTS+备用液。参照周晔[18]等方法，将备用液用70%乙醇稀释得ABTS+工作液。分别取不同浓度腰果总酚提取液 ABTS+工作液按 0.1 ∶3.9 体积比混合，室温 25 ℃避光反应 6 min～10 min 后测定吸光值（A样品）；以蒸馏水和ABTS+工作液混合进行空白试验（A空白）。

ABTS+自由基清除率/%=（A空白－A样品）/A空白×100

1.3.5.3 铁还原力测定

取 pH 值为 6.6 磷酸缓冲液 1 mL，加入 200 μL 腰果多酚提取液、10 mL 铁氰化钾溶液（1 g/L）后50 ℃恒温水浴20 min；加入1 mL 10 %的三氯乙酸溶液2 500 r/min离心20 min 取上层清液2 mL；加入1 mL 三氯化铁溶液（1 g/L）、2.0 mL 蒸馏水，振荡混匀，700 nm处测定光吸收值。以同浓度的VC为对照。

1.4 数据处理

用SPSS 17.0 进行数据处理，单因素试验做3 次平行，用One-WayANOVA 进行方差分析，采用Tukey’s multiple range test 检验各处理间的差异，显著水平P=0.05，具有不同英文小写字母表示差异显著。腰果叶多酚抗氧化效采用成对样本t 检验进行显著性分析，显著水平P=0.05。

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线方程的确定

经过对没食子酸标准品浓度和765 nm 波长处吸光度A 有关数据的记录和分析，绘制标准曲线见图1。

通过测定，没食子酸质量浓度与吸光值A 之间的曲线回归方程为 y=0.001 9x+0.088 6（R2=0.975），线性关系良好。腰果多酚提取物含量测定能根据此方程计算得到。

2.2 腰果叶多酚提取单因素试验结果分析

2.2.1 丙酮体积分数对腰果叶多酚得率的影响

丙酮体积分数对腰果叶多酚得率的影响见图2。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

图2 丙酮体积分数对腰果叶多酚得率的影响Fig.2 Effects of acetone volume fraction on extraction yield of polyphenols

由图2 可知，丙酮体积分数为55%、65%时，对腰果叶多酚提取率为9.49%、9.31%，与其他体积分数形成显著差异，表明丙酮体积分数对腰果叶多酚提取率有影响。丙酮体积分数为55%时多酚提取率达到最大值，随后有所下降，原因可能是丙酮体积分数过高，脂溶性物质溶出增大，从而影响了腰果叶多酚的提取率。因此选择丙酮体积分数为55%作为最佳提取条件。

2.2.2 提取温度对腰果叶多酚得率的影响

提取温度对腰果叶多酚得率的影响见图3。

图3 提取温度对腰果叶多酚得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of polyphenols

由图3 可知，提取温度为 50、60、70 ℃时，对腰果叶多酚提取率为8.35%、8.85%、8.68%，与其他提取温度形成显著差异，表明提取温度对腰果叶多酚提取率有影响。60 ℃以下温度提取率与温度呈正相关，60℃以上提取率与温度呈负相关，推测是温度上升对多酚的化学结构造成了影响，从而降低了提取率。综合考虑原料和试剂消耗等因素，选取为提取温度50、60、70 ℃用于响应面试验。

2.2.3 超声波处理时间对腰果叶多酚得率的影响

超声波处理时间对腰果叶多酚得率的影响见图4。

图4 超声波处理时间对腰果叶多酚得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on extraction yield of polyphenols

由图4 可知，超声波处理时长为70、90、110 min时，对腰果多酚提取率为8.53%、8.70%、8.43%，与其他超声波处理为时间形成显著差异，表明超声波处理为时间对腰果叶多酚提取率有影响。处理时间超过90 min 多酚提取率呈下降趋势，推测是超声波长时间作用使部分多酚分子结构被破坏，导致多酚提取率降低。综合考虑原料和试验时长等因素，选取超声波处理时长70、90、110 min 用于响应面试验。

2.2.4 料液比对腰果叶多酚得率的影响

料液比对腰果叶多酚得率的影响见图5。

图5 料液比对腰果叶多酚得率的影响Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on extraction yield of polyphenols

结果表明，料液比对腰果多酚提取率的影响差异不显著。

2.3 响应面试验

运用Desert-expert8.0.1 设计Box-Behnken 响应面优化试验结果见表2，模型方程方差分析结果见表3。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

腰果叶多酚提取率与丙酮体积分数（A）、提取温度（B）、超声波处理时间（C）之间的二次多项式模型为：

Y=37.515 75+0.461 6A + 0.364 2B + 0.531 2C -0.000 2AB+0.000 65AC + 0.000 175BC - 0.003 81A2-0.002 91B2-0.003 09C2。

回归模型 P＜0.000 1，失拟项 P=0.290 5＞0.05，模型具有高度的显著性，对腰果叶多酚提取率有充分的理论预测。模型系数R2=0.986 0，提取溶剂、温度、超声波处理时间与提取率之间的真实关系在方程上体现出来。模型的变异率不到1.5%，可采用此模型确定丙酮体积分数、超声波作用时间、提取温度最佳提取工艺条件。

二次模型中回归系数的显著性检验表明：对多酚提取率影响主次顺序依次为：丙酮体积分数＞超声波作用时间＞提取温度。因素 A 和 A2、B2、C2对多酚提取效果的线性效应极显著（P＜0.01）。

2.4 体积分数、温度、超声波作用时间交互作用分析

丙酮体积分数、温度、超声波作用时间响应曲面见图6。

图6 丙酮体积分数、温度、超声波作用时间响应曲面图Fig.6 Response surface plot of acetone volume fraction，temperature and ultrasonic response time

交互作用曲面比较平滑的为AB，接近圆形的等高线，交互作用曲面比较陡峭的为AC 和BC，偏向椭圆的等高线，根据表3 显著性可知AB、AC 和BC 交互作用均不显著（P＞0.05）。

2.5 验证模型及条件确定

腰果叶多酚提取的最优工艺条件为丙酮体积分数57.90%、提取温度58.79 ℃、超声波处理时间89.49 min，此时响应面模型预测提取率为10.33%。为简化操作，选丙酮浓度60%，提取温度60 ℃，超声辅助提取时间90 min，按此条件进行5 次平行验证试验，多酚提取率平均值为10.29%，接近模型预测值10.33%，说明该模型可运用在实践中。

2.6 腰果叶多酚抗氧化效应

2.6.1 腰果叶多酚对DPPH 自由基清除效应

腰果叶多酚提取物和VC对DPPH 自由基清除能力见图7。

图7 腰果叶多酚提取物对DPPH 自由基的清除率Fig.7 DPPH free radical clearance rate by polyphenol extract from cashew leaves

腰果叶多酚提取物对DPPH 自由基清除率随浓度升高而加大，当腰果叶多酚提取物浓度为5 mg/L 时，清除率为62%。腰果多酚提取物对DPPH 自由基的清除效应比同浓度的VC高，自由基清除效果较好。

2.6.2 腰果叶多酚对ABTS+自由基清除效应

腰果叶多酚提取物和VC对ABTS+自由基清除能力见图8。

图8 腰果叶多酚提取物对ABTS+的清除率Fig.8 ABTS+free radical clearance rate

腰果叶多酚提取物对ABTS+自由基的清除效应随着浓度的增大而增强，最高清除率为82%。各组浓度下，腰果叶多酚提取物对ABTS+自由基的清除效应比同浓度的VC高，自由基清除效果较好。

2.6.3 还原力测定

腰果叶多酚提取物还原力测定见图9。

图9 Fe3+还原力测定Fig.9 Fe3+reducing power determination

通过测定铁离子的还原力来表示腰果叶多酚提取物抗氧化活性的强弱。相同浓度下腰果叶多酚提取物的还原力均高于VC。

3 结论

本试验通过超声波辅助提取腰果叶多酚并对其抗氧化作用进行探讨。在单因素试验基础上，通过Box-Behnken 响应面优化腰果叶多酚提取工艺。优化结果为丙酮体积分数60%，提取温度80 ℃，超声波处理时间时间90 min，在此条件下腰果叶多酚提取率为10.29%，与10.33%的预测值接近。通过腰果叶多酚提取物对DPPH 自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，铁离子还原能力，得出腰果叶多酚提取物具有抗氧化能力，抗氧化性高于同浓度天然VC，对研究腰果叶多酚的有效开发具有一定意义。