不同产地卷柏属药用植物的HPLC指纹图谱研究

李焕婷，安 明，贾克文，张 茹，高博闻

(包头医学院，内蒙古 包头 014040)

1 前言

在我国出产的卷柏属植物约为70多种，其中有20多种具有药用价值[1]，广泛分布于我国东北、华北、华东、中南及陕西、四川等地。垫状卷柏又名九死还魂草，为中国药典2015年版所收载品种，其化学成分结构复杂，生物活性强，具有活血通经之功效[2]。

近几年，越来越多的学者对卷柏中化学成分进行分析，因此，在卷柏中通过提取分离并鉴定出一系列新的、复杂的化合物。其中，黄酮类、酚炔类等化合物都具有较好的药理活性。卷柏分布极其广泛，具有良好的药用价值，但是对于不同产地卷柏化学成分的研究比较少。本次实验以我国不同地区的卷柏为研究对象，利用HPLC法分析不同地区卷柏化学成分的差异；通过指纹图谱处理软件分析不同种卷柏的共有峰、相似度，为其临床用药、质量控制提供依据。

2 实验仪器与材料

2.1 实验仪器

实验中主要仪器见表1。

表1 实验仪器

2.2 实验材料与试剂

实验中所用到的五种产地卷柏及所用试剂见表2和表3。

表2 卷柏药材来源

表3 实验试剂

3 实验方法

3.1 色谱条件

色谱柱为Ultimate LP-C18(4.6mm×250mm,5.0μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱(见表4)，流速1.0mL/min，检测波长330nm，柱温为30℃，进样量为20μL。

表4 流动相梯度洗脱条件

3.2 供试品溶液的制备

称取卷柏粉末约2g，置于小烧杯中，精密加入80%(体积分数下同)甲醇20mL，保鲜膜密封，用电子天平称其质量，在50℃下超声提取40min，放冷，然后再一次称其质量，用80%甲醇补足差量，摇匀，过滤，再经0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液进样。

3.3 方法学考察

3.3.1精密度实验

精密量取供试品溶液S3，按照3.1中所列的色谱条件24小时内连续进样六次。

3.3.2重复性实验

精密量取供试品溶液S3六份，按照3.1中所列的色谱条件24小时内连续进样六次。

3.3.3稳定性实验

精密量取供试品溶液S3，按照2.1中所列的色谱条件24小时内每隔4小时检测一次。

4 结果与讨论

4.1 卷柏样品HPLC指纹图谱与相似度评价

按照3.1中所列的色谱条件，测出5个样品的高效液相色谱图，将5个色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版。经系统处理，得到5种产地供试品的相似度(见表5)、共有峰(见图1)，最终确立了6个峰为5个样品的共有峰，同时得到这6个共有峰在5个供试品HPLC色谱图中的保留时间、峰面积(见表6)。共有峰的选取原则为5批样品都含有的峰，且出峰时间合适并与其临近的峰分离良好[3]。

表5 HPLC图谱相似度评估结果

表6 共有峰的峰面积与保留时间

4.2 方法学考察结果

4.2.1精密度实验

实验表明，主要共有峰相对保留时间RSD均小于2.67%，相对峰面积RSD均小于4.31%，表明该方法精密度良好。

4.2.2重复性实验

实验表明，主要共有峰的相对保留时间RSD小于1.78%，相对峰面积RSD小于2.56%，表明该方法重复性良好。

4.2.3稳定性实验

实验显示，共有峰的相对保留时间均小于2.93%，相对峰面积的RSD值小于1.24%，表明样品溶液在一定时间内稳定性好。

4.3 讨论

4.3.1检测波长的选择

于全波长检测器下对供试品溶液进行分析，在波长330nm处色谱峰最多、紫外吸收良好，最终确定在330nm波长下对供试品溶液进行检测。

4.3.2流动相的选择

通过选用不同流动相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸)、不同洗脱条件进行实验，结果甲醇-0.1%磷酸水在相应梯度条件下得到的色谱峰分离效果最好。

5 结论

在指纹图谱处理软件中，以湖北卷柏HPLC图谱为参照，以中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.20，进行色谱峰自动匹配，生成了5种产地卷柏的指纹图谱，并得到6个分离度较好的共有峰；各共有峰的相对保留时间一致，相对峰面积则存在较大差异，说明不同来源的卷柏生长表型不同，但含有一定的共有成分，只是含量有所差异；5种产地卷柏相似度高达0.901～0.983，说明各地卷柏所含化学成分极其相似。该实验方法简单易行，可作为卷柏质量控制及指纹图谱建立的方法。