阿尔茨海默病中Tau蛋白与线粒体损伤

赵俊一,钟伟聪,邓云松,肖时锋

(深圳大学生命与海洋科学学院,中国广东 深圳 518060)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最为常见的一种神经退行性疾病,其主要特点为记忆缺失和认知损伤,主要病理特征是神经细胞间β 淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)多肽组成的淀粉样沉积(senile plaques,SP)、神经细胞内过度磷酸化tau 蛋白组成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)以及神经元丢失[1]。《2018年世界阿尔茨海默病报告》的数据显示,全球AD 患者人数约5 千万,2018年全球AD 相关花费为1 万亿美元。AD 已经成为患者、家庭和社会的沉重负担,其发病机理尚未完全清楚,目前针对AD 的药物只能缓解病情,并无法有效治疗。

相关生物信息学分析表明,在AD 患者的后扣带回皮层和海马CA1 区分别有70%和61%编码线粒体电子传递链蛋白质的基因表达量显著降低[2]。AD 患者的脑部尸检结果呈现线粒体功能受损以及神经元功能障碍[3]。电镜形态测定分析显示,AD 患者多个脑区的神经元中线粒体的形态改变且数量明显减少[4]。相关研究报道,细胞色素c 氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)缺陷的海马锥体神经元和脉络膜上皮细胞在AD 患者脑中普遍存在,并且这类细胞的数量较同年龄对照组更多,说明AD 患者中细胞的线粒体酶活性缺陷比正常老年人更普遍[5]。一项人群调查结果显示,线粒体乙醛脱氢酶2 (aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)的缺乏增加了患晚发性AD 的风险[6]。蛋白质组学研究发现,细胞色素c 氧化还原酶核心蛋白1 在AD 患者的颞叶皮质中显著减少,从而导致线粒体能量代谢异常[7]。Aβ 和磷酸化的tau 蛋白可以直接导致线粒体功能障碍,而功能障碍的线粒体随后又加快了AD 的病理进程[8]。总而言之,多项研究表明AD 中存在线粒体损伤,其在AD 发病机制中发挥重要作用,是AD 的早期病理事件。本综述主要根据近年的报道总结了AD 中病理性tau 蛋白对线粒体动力学、形态、自噬、功能等方面的损伤,进一步从线粒体方向阐述了tau蛋白引发AD 的分子机制,并就从保护线粒体损伤角度研发防治AD 药物的可行性进行了讨论。

1 Tau蛋白的结构和功能

Tau 蛋白是一种微管相关蛋白质,其主要功能是与微管蛋白结合,促进微管组装,稳定微管并调节微管动态稳定性。人源tau 蛋白由位于17号染色体(17q21)的单基因MAPT (microtubule-associated protein tau)编码。人脑内有6 种tau 蛋白异构体,是通过选择性剪切外显子2、3 和10 形成的。Tau 蛋白包括N 端突出区域、富含脯氨酸区和C 端微管结合区,而C 端又包含4 个微管结合重复序列：R1、R2、R3 和 R4。根据有无 R2 可将tau蛋白分为3R-tau 蛋白和4R-tau 蛋白两类。Tau 蛋白是天然的去折叠蛋白质,无稳定的二级和三级结构,呈现无规则卷曲结构[9]。周期蛋白依赖性激酶 5 (cyclin-dependent kinase 5,CDK5)、P35、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)等激酶以及蛋白磷酸酶1 (protein phosphatase 1,PP1)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、蛋白磷酸酶2B (PP-2B)、蛋白磷酸酶2C (PP2C)、蛋白磷酸酶5 (PP5)等磷酸酶之间的作用不平衡会导致tau 蛋白的过度磷酸化[10～11]。过度磷酸化的tau 蛋白会从微管上脱落,自身聚集形成纤维丝,并进一步缠绕形成NFTs,这些改变可导致细胞骨架网络的不稳定,同时可破坏轴突运输。除磷酸化外,tau 蛋白还存在其他翻译后修饰,包括糖基化、乙酰化、截短、泛素化、SUMO 化等[12]。Tau 蛋白在赖氨酸残基上的乙酰化可以中和赖氨酸残基的正电荷,而tau蛋白微管结合区上存在大量赖氨酸,这就使得tau 蛋白与微管脱离进而病理性聚集[13]。SUMO 化可使tau 蛋白的溶解度降低,从而引起tau 蛋白聚集,这可能是病理条件下tau 蛋白清除受损的一个因素[14]。研究报道,SUMO 化相关基因的变异与散发性晚发性AD 之间存在联系,tau 蛋白的SUMO 化可能与泛素化和磷酸化相互作用[14～15]。糖基化的tau 蛋白在体外对微管的亲和力降低,从而有助于tau 蛋白过度磷酸化[16]。N 末端部分被截短的Gln124-tau 片段显示出更强地结合微管和使其免于解聚的能力。Tau 的N 末端截短还影响tau 的其他性质,例如tau 的聚合和细胞定位[17]。

Tau 蛋白异常聚集形成的NFTs 是AD 的主要病理特征之一,但是tau 蛋白的聚集过程造成神经元凋亡的具体机制尚不清楚。基于病理性的tau 蛋白可以直接导致线粒体损伤的研究结果,tau 蛋白的异常状态及其与线粒体的内在联系可能也是导致AD 发病的原因之一。蛋白质组学分析发现,敲入tau-P301L 基因的小鼠出现了线粒体功能障碍,具体表现在氧化呼吸链复合物表达水平降低、电子传递链受损和ATP 合成减少[18]。然而有报道指出,tau 蛋白的过表达可以拮抗由Aβ诱导的线粒体caspase-3 途径的细胞凋亡,同时维持B 淋巴细胞瘤-2 (B cell lymphoma-2,Bcl-2)的水平和抑制Bax、细胞色素c 以及caspase-3 的活性,以抑制细胞凋亡[19]。因此,弄清楚tau 蛋白与线粒体的关系有助于揭示AD 的发病机制。

2 Tau蛋白影响线粒体的转运和动力学

微管是细胞骨架的主要成分之一,参与神经元形态的维持和轴突、树突的形成[20]。驱动蛋白和动力蛋白沿着微管滑行,将蛋白质、突触小泡和线粒体等物质运送到细胞各处,以满足细胞各种生理活动的需要。线粒体是细胞的“动力工厂”,其通过有氧呼吸产生能量供细胞使用,马达分子携带着线粒体在细胞内转运可以将其产生的能量在细胞内进行合理的分配。线粒体还是细胞内的钙库,调节细胞钙稳态。有研究者用rTg4510 小鼠的脑切片进行免疫组化实验,发现在Alz50 阳性的神经元中线粒体的分布被打乱; 在抑制可溶性tau 蛋白表达后,这种现象被完全逆转并恢复正常。有意思的是,在AD 患者大脑的Alz50 阳性神经元中人们也发现了类似的tau 相关线粒体转运受阻现象[21],提示tau 蛋白的状态可能和线粒体的转运存在联系。

Tau 蛋白本身可以影响线粒体的转运而不依赖于它的修饰状态。研究者通过线粒体实时成像技术发现,在过表达tau 蛋白的小鼠海马神经元中大部分线粒体在胞体和神经元中是静止的,而在不过表达tau 的神经元中线粒体在胞体和轴突中快速移动,表明过度表达tau 蛋白阻断了线粒体的转运[22]。相关研究报道,tau 蛋白的过度表达还能够使神经元中线粒体的运动暂停频率增加16%,减少线粒体的顺向运动[23]。线粒体分裂和融合之间严格的平衡被打破后会对细胞的功能和存活产生负面影响。增加融合会导致线粒体伸长,分裂过度又将导致其碎片化,进而导致其功能受损。这些缺陷均可能导致线粒体的运动性降低、能量产生减少和氧化应激增强。动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)组装成环状围绕在细长的线粒体周围,与线粒体外膜蛋白如线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor,Mff)、分裂蛋白1 (fission protein 1,Fis1)相互作用,介导线粒体的分裂。线粒体的融合由融合蛋白1 (mitofusion 1,Mfn1)、融合蛋白2 (Mfn2)和视神经萎缩症蛋白1 (optic atrophy 1,OPA1)介导。Mfns 位于线粒体外膜,可通过泛素化信号通路被蛋白酶体降解; OPA1 位于线粒体内膜,两者相互作用形成线粒体的膜间复合物,促进线粒体外膜和内膜的融合。研究报道,在表达人源全长tau 蛋白的HEK-293tau 细胞和转tau 基因小鼠的海马中均可检测到核周线粒体的积累,细胞内无线粒体的区域增加,以及线粒体的形态变得细长。该研究显示,tau蛋白的病变增强了线粒体逆行的转运率,显著增加了线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2 和OPA1 的量,并减少了多泛素化Mfn2 的水平,但未改变分裂蛋白Fis1 和Drp1 的量,表明泛素化受损可能是tau 蛋白诱导Mfns 积累的基础。在此基础上,人们进一步敲低Mfn1 或Mfn2,结果减弱了线粒体的融合和积累,而下调OPA1 的表达并没有逆转tau蛋白诱导的线粒体损伤[24]。因此,tau 蛋白导致的线粒体融合紊乱可能与Mfn1 和Mfn2 密切相关,过表达tau 可能通过Mfn1 和Mfn2 导致线粒体的体积变大,进而降低线粒体的移动速率,阻断线粒体的转运,使得其运动暂停。

Tau 蛋白的修饰也可影响线粒体的转运和动力学。Tau 蛋白的磷酸化影响线粒体转运的报道最为常见。慢性应激小鼠海马中tau 磷酸化水平增加,同时其突触体中具有更多的线粒体,并且线粒体的数量随着tau 磷酸化水平的降低而减少[22]。在敲入tau-P301L 基因的小鼠原代神经元中轴突线粒体运动不受影响,OPA1 和Mfn2 的量没有明显变化,但线粒体的数量显著减少,同时其体积和沿轴突运输方向的定向角显著增加。这种改变可导致轴突线粒体的暂时阻塞或流动减少,即使不影响它们的整体转运动力学,也可增加线粒体融合的可能性并减少轴突中线粒体的数量[25]。进一步的研究发现,敲入tau-P301L 基因的小鼠神经元中存在tau 磷酸化降低的现象,同时PP1 的表达量降低了近1/3,PP2A 的表达量基本不变,说明tau 低磷酸化不是由于这些磷酸酶的表达增加,而可能是由于一些激酶的表达水平或活性降低,或者是tau 的构象被改变从而阻止了磷酸化的发生[25]。另有文献报道,用LiCl 处理原代海马神经元后,tau 磷酸化水平降低,同时线粒体转运也被抑制[22]。除了磷酸化,截短的tau 蛋白也会对线粒体运动造成损伤。人们发现,表达N 端截短tau (NH2htau)的神经元表现出球状变性线粒体的“贩运堵塞”,使线粒体分布不均匀,从而出现类似于“串珠”状的分布,且大部分聚集在细胞核周围[26]。这可能与NH2htau 具有更强的微管结合能力有关。大量NH2htau 更牢固地结合在微管上,影响微管的解聚和重聚,进而阻止线粒体在微管上的转运。T4C3 截短的tau 蛋白在原代神经元中过表达会引起OPA1 的水平显著降低,破坏线粒体分裂、融合的平衡,导致线粒体破碎[27]。其他tau蛋白的修饰是否会对线粒体运动或动力学产生影响还有待进一步探索。

3 Tau蛋白影响线粒体的形态和自噬

线粒体自噬是细胞选择性自噬的一种,主要是为了清除过剩或受损的线粒体。线粒体自噬可以减少受损线粒体的聚集,对于维持细胞正常的生命活动具有重要作用。研究报道,AD 患者的海马样本中存在线粒体自噬缺陷,海马神经元的受损线粒体数量变得更多,且形态发生改变,变得更小[28]。

线粒体的分裂和融合调节线粒体的长度和大小,与线粒体的自噬之间存在着联系[29]。线粒体的分裂增强可促进受损的线粒体通过自噬途径清除。研究发现,饥饿状态下细胞cAMP 水平增加,激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),促进Drp1的磷酸化,使其滞留在细胞质中,不能调节线粒体分裂,从而使线粒体免受自噬清除[30]。此外,相关研究报道,在表达NH2htau 蛋白的神经元中线粒体出现异质性改变,变得较短,呈球状,有斑状基质,内嵴完全消失,这跟AD 患者体内发现的线粒体形态的变化非常相似[26]。透射电镜观察结果显示,稳定转染野生型tau 的SH-SY5Y 细胞的线粒体超微结构是正常的,具有典型的嵴; 而过表达tau-P301L 的细胞其线粒体形态是球状结构,具有分支的嵴膜[31]。线粒体嵴形态的改变与线粒体功能障碍呈相关性,因此tau 蛋白的截短形式NH2htau 和突变形式tau-P301L 可以通过影响线粒体的形态进而影响线粒体的功能,促进其通过自噬清除。前文提及AD 患者海马神经元中显现出受损线粒体的积累,推测线粒体体积变小可能是机体应对线粒体自噬障碍的一种措施。

PINK1/Parkin 通路是线粒体自噬的一种常见途径,是帕金森病中功能障碍的线粒体自噬的主要方式,但在AD 中的研究不多。PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1)是一种蛋白激酶,通过磷酸化Parkin 蛋白,使其选择性募集到受损线粒体上,从而介导线粒体自噬。研究报道,在AD 患者中Parkin 蛋白显著减少,且电镜形态测定分析显示,AD 患者多个脑区的神经元中线粒体数量明显减少,提示线粒体通过非选择性自噬的清除增加; 而上调Parkin 的表达可以降低细胞内Aβ 的水平和细胞外脂质斑块的沉积,同时也可促进受损线粒体以自噬方式被选择性清除[32]。研究显示,病理性的tau 可影响线粒体的选择性自噬。在过表达NH2htau 的细胞中,Parkin 和细胞质泛素-C-末端水解酶L1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolases L1,UCHL-1)异常募集到线粒体,从而导致突触可塑性损伤,发生有害的线粒体自噬清除; 沉默UCHL-1 和Parkin 的基因表达可恢复突触和线粒体功能,对由NH2htau 诱导的神经元凋亡有保护作用[33]。在过表达tau 的HEK293 细胞中,线粒体膜电位增加,发生超极化,这抵消了启动线粒体自噬所需要的去极化信号,进而减少了PINK1和Parkin 在线粒体中的滞留,导致线粒体自噬缺陷; 而上调Parkin 可以缓解由tau 过表达诱导的线粒体自噬缺陷[34]。最近有研究发现,在过表达tau和tau-P301L 的N2a 细胞中,tau 蛋白与 Parkin蛋白相互作用,使其停留在细胞质中,阻止其募集到受损线粒体上,进而抑制线粒体自噬[35]。因此,病理性的tau 蛋白很有可能是通过PINK1/Parkin通路影响线粒体自噬。

4 Tau蛋白影响线粒体的功能

线粒体的主要功能是通过三羧酸循环和氧化磷酸化产生ATP,给细胞提供能量。在AD 病人和转基因AD 小鼠中人们均发现,与线粒体代谢功能相关的关键酶如细胞色素c 氧化酶、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)等的表达水平及活性显著下降,并最终导致ATP 生成量减少[36]。诸多报道证明AD 中的线粒体功能障碍与tau 蛋白有关。Rhein 等[37]将转 tau-P301L 基因的 pR5 小鼠与转淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)和早老素2 (presenilin 2,PS2)编码基因的双转基因APP152 小鼠杂交产生3×Tg 小鼠,随后对3×Tg 小鼠进行蛋白质组学分析,发现24 种蛋白质表达失调,其中有三分之一是线粒体蛋白质,主要同参与氧化磷酸化的复合物Ⅰ以及复合物Ⅳ相关。有意思的是,复合物Ⅰ的失调在pR5 小鼠中出现,复合物Ⅳ的失调在APP152 小鼠中出现,说明复合物Ⅰ的失调是tau 依赖性的,而复合物Ⅳ的失调是Aβ 依赖性的。此外,相对于1×Tg 和2×Tg 小鼠,3×Tg 小鼠中 ATP 的合成、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生都表现出更严重的缺陷,表明Aβ 和tau 在诱导线粒体缺陷方面具有协同作用[37]。另有研究显示,在体外培养的原代神经元中过表达tau 蛋白能够降低ATP 的水平和ATP/ADP 的比例,同时在细胞培养72 h 后抑制复合物Ⅰ的活性,会导致细胞存活率显著降低[24]。在对FTDP-17 患者中诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)衍生的神经元进行实验时人们发现4R-tau 产量增加,同时线粒体膜电位增加、线粒体NADH 量降低、复合物Ⅰ活性降低、ATP 产量减少、ROS 大量增加,这进一步证实病理性tau 蛋白可造成线粒体功能损伤[38]。Tau 蛋白Asp421 处的截断发生在阿尔茨海默病早期,该截短的tau 蛋白在神经元细胞模型中可引起氧化应激水平增加、胞内钙离子水平上升、线粒体膜电位降低,从而破坏线粒体膜的完整性,导致线粒体功能障碍[39]。进一步研究表明,该截短的tau蛋白还能够显著增强原代神经元中Aβ 诱导的线粒体损伤,表明该tau 蛋白截短体和Aβ 协作损害线粒体功能,这可能是AD 中神经元功能障碍的原因之一[40]。

目前,关于tau 蛋白影响线粒体功能的机制尚未有明确定论。最近有研究认为,tau 蛋白通过激活细胞的未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR)导致线粒体功能障碍。他们发现在转tau 和tau-P301L 的 SH-SY5Y 细胞中分别有 48和52 个UPR 基因上调,同时ATP 产量和线粒体膜电位均下降[41]。过表达tau 会激活UPR 系统,细胞为了减缓内质网应激压力,可能会通过影响核糖体的装配,抑制蛋白质翻译,使线粒体蛋白质的合成受阻,从而引起线粒体功能障碍。

也有研究认为tau 蛋白是通过破坏线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)导致线粒体功能损伤的。mPTP 主要由3 种蛋白质组成：位于线粒体基质中的亲环蛋白D(cyclophilin D,CyPD),存在于内膜上的腺嘌呤核苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator,ANT),以及位于线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)[42]。mPTP的失衡不仅会破坏线粒体和细胞质之间的代谢梯度,包括积累的钙的释放,还会导致线粒体的渗透性肿胀。当mPTP 被破坏,线粒体内膜不再保持对质子的屏障,从而导致质子动力的消散。由此产生的氧化磷酸化解偶联会阻止线粒体产生ATP,导致ATP 消耗和ROS 的产生增加。线粒体肿胀可能通过释放细胞色素c 使线粒体外膜破裂,同时细胞色素c 又可通过激活促细胞凋亡因子启动细胞凋亡。因此,在病理条件下大量mPTP的破坏会导致严重的线粒体损伤和细胞死亡。相关研究发现,在AD 患者大脑皮质组织中VDAC1的水平升高,VDAC1 能够与AD 患者或转基因AD小鼠脑中的Aβ 和磷酸化tau 相互作用,从而阻断mPTP,导致AD 患者中的线粒体功能障碍[43]。NH2htau 被发现在AD 患者脑部突触线粒体中大量富集,并且其在突触末端区域中的水平与病理性突触变化和线粒体功能损伤相关[44]。在AD 患者突触的线粒体中,NH2htau 比全长tau 蛋白更易与CyPD 和ANT-1 结合,从而抑制依赖于ANT-1的ADP/ATP 转换,造成线粒体功能障碍[45]。Asp421处截断的tau 蛋白可以影响mPTP 的开放,mPTP抑制剂环孢菌素A (ciclosporin A,CsA)可预防该tau 截短体引起的线粒体膜电位降低,并减轻钙超载对线粒体膜完整性带来的破坏[39]。

5 结语和展望

病理性的tau 蛋白,包括聚集物、突变型蛋白质、翻译后修饰、截短型蛋白质、剪切异构型等,可造成线粒体在转运、动力学、形态、功能等方面的损伤,也可通过抑制线粒体自噬途径导致受损的线粒体无法被清除,从而导致神经元受损甚至凋亡。2003年至今还没有治疗AD 的药物被批准,大部分针对Aβ 或APP 剪切酶的AD 药物的失败[46],迫切需要我们寻找新的治疗靶点。相关研究表明,增强线粒体功能和线粒体蛋白质的稳定性可以减少有害蛋白质聚集体的形成[47]。因此,逆转病理性tau 蛋白引起的线粒体损伤或增强线粒体自噬为研发防治AD 的药物提供了一个可行的策略。研究报道,用冈田软海绵酸(okadaic acid)孵育的SH-SY5Y 细胞呈现出tau 蛋白的过度磷酸化、线粒体损伤及神经元萎缩,而euscaphic acid和corosolic acid 两种三萜酸化合物能够降低这些细胞中的tau 蛋白磷酸化水平,同时减少线粒体ROS 水平,增加线粒体膜电位,最终达到保护神经元的目的[48]; 用线粒体靶向抗氧化剂SkQ1 治疗12 至 18 月龄的 AD 模型 OXYS 大鼠后,线粒体的结构和功能得到改善,神经元丢失和突触损伤被逆转,海马中Aβ1-42和tau 蛋白过度磷酸化的水平被降低,大鼠的学习能力和记忆力得到提高[49]。另有研究显示,植物提取物淫羊藿苷可调节3×Tg-AD 小鼠中线粒体分裂与融合的平衡以及线粒体关键酶的表达,保护线粒体的形态与分布,促进线粒体转运,维持细胞的能量生成,最终实现干预 AD 的发生、发展[50～51]。此外,有研究者用线粒体自噬诱导剂尿石素A (urolithin A)处理转tau 基因的线虫模型(BR5270),发现其记忆障碍得到恢复,并且这一逆转过程依赖于PINK1 线粒体自噬通路[28]。综上所述,AD 中病理性tau 蛋白与线粒体损伤存在密切的关系,以线粒体为靶点对AD 进行干预是非常重要的,或将成为未来防治AD 的新方法。