小檗红碱及其衍生物的制备与应用研究进展

2020-02-21王国胜齐飞高艺伟奚洋张子阳

云南化工 2020年12期

王国胜，齐飞，高艺伟，奚洋，张子阳

（沈阳化工大学化学工程学院，辽宁沈阳 110042）

小檗红碱（berberrubine，BRB），也叫盐酸小檗红碱，分子式：C19H16NO4·Cl，相对分子质量：357.79，纯度98%以上，红色晶体，熔点245℃，可溶于酸性溶液，不溶于石油醚、氯仿等溶剂。储藏要求避光、低温下保存，保存温度在2～8℃。小檗红碱的分子结构特征与小檗碱的一样同属于异喹啉结构，也称为脱甲基小檗碱，存在于许多中药材中，如黄连，黄柏等。近年来，随着小檗碱的临床应用以及开发研究的深入［1-6］，小檗碱与小檗红碱的转化关系［7］，构效关系［8，9］以及小檗红碱的药理与毒理作用［10，11］引起了广泛的重视，临床中发现小檗红碱也具有一定的体外抗菌活性、体内抗肿瘤活性以及调脂活性［12，13］，由于其作用机制与他汀类药物完全不同且有良好的安全性，被认为有望取代他汀类药物的新靶标药。目前，随着对小檗红碱以及小檗红碱衍生物的药用以及临床应用研究的深入，对小檗红碱的制备必将引起关注。未来，小檗红碱的工业化生产将成为急需解决的问题。同样，加大小檗红碱及其衍生物的制备技术、药用机制、临床应用以及应用领域的开发等无论在学术研究还是新药开发领域都会成为新的热点和增长点。

1 小檗红碱的制备技术

1.1 天然产物的提取分离

小檗红碱存在于黄连、黄柏、三颗针等中药材中很早就已经被证明了。对盐黄柏、二妙丸等的比照样品分析表明［14-16］，其中，小檗红碱相对于小檗碱的含量较少，含量仅仅在0.2%～1.3% （质量分数）。小檗红碱最早是从欧小檗（Berberis vulgaris L）中分离得到的，随后，从黄连中分离出小檗红碱也获得成功［17，18］。对裂叶星果草采用乙醇提取，经过荧光切割、柱色谱纯化和离心薄层制备得到盐酸小檗红碱［19］。由于中药材中小檗红碱的含量较少，由天然产物提取小檗红碱的技术难以工业化。但是，提取得到的小檗红碱的重要信息，如熔点、紫外、红外、核磁、质谱等的分析数据为小檗红碱的物性、性能以及开发利用提供了科学基础。

1.2 中药的炮制转化

采用高效液相色谱测定不同炮制方法、不同炮制温度对黄连酒灸品种的生物碱含量的变化研究表明［20］，酒灸黄连随着加热温度的增加，生物碱在160℃时的含量最高，在170℃时出现新的化学成分小檗红碱。对黄柏及其饮片的炮制过程中生物碱成分的变化研究［21-24］，得到同样的结论。即随着炮制温度的变化，黄柏中的生物碱的成分发生了变化，生成新的化学成分小檗红碱，其含量随着温度的升高而增加。上述研究不仅仅发现了生物碱成分的变化，更主要的是转化的温度，以及转化为新的化学成分是小檗红碱，这为以小檗碱为原料，通过去甲基化转化为小檗红碱的化学合成提供了有力的佐证。

1.3 小檗碱的代谢转化

采用混合人肝微粒体和重组人源细胞色素酶对小檗碱的酶反应动力学研究表明［25］，小檗碱在体外混合人肝微粒体温孵体系中的主要代谢途径为O-去甲基化，可生成小檗红碱。在对盐酸黄连碱和小檗红碱在人源细胞单层模型中的吸收研究表明［26］，给大鼠灌胃小檗碱，在血浆中检测到其主要代谢产物为小檗红碱。对小檗碱的药动学和代谢研究表明［27］，采用液质联用技术对健康自愿者和患者的血浆进行检测，发现小檗碱的主要代谢产物是小檗红碱，且小檗红碱比小檗碱的亲油性强，其药物活性也比小檗碱强。对小檗碱的代谢过程以及代谢产物的研究，不仅证明了小檗碱的代谢产物为小檗红碱，也为生物转化制备小檗红碱提供了新的思路。

1.4 小檗碱的脱甲基化

将盐酸小檗碱经过氨水和氯仿处理得到氯仿小檗碱，将其装入硅胶柱，用氯仿与甲醇过柱洗脱，能得到小檗红碱［28］。同样，小檗碱经过层析柱发生脱甲基化也能得到小檗红碱［29］。研究表明［7，30］，小檗碱和小檗红碱可以互相转化。目前，通过将小檗碱脱甲基化制备小檗红碱已成为实验室经常采用的方法。

1）真空热解技术［31］。以小檗碱为原料，在高于160℃条件下，采用高温脱甲基化可得到小檗红碱，但是收率低，副产物多，分离提纯困难。在真空条件下，或者在二氧化碳与氮气等惰性气体保护得条件下，可减少副产物，提高收率。

2）成酯水解技术［32］。以小檗碱为原料，在盐酸吡啶及醋酐中回流，C9位脱去甲基，同时酯化生成9-酰基-9-去甲基小檗碱。在氢氧化钠溶液中水解生成小檗红碱，总收率71%～88%。该法脱甲基温度低（140℃），产物纯度和收率较高。

3）微波辅助技术［33，34］。以高沸点稳定性高的极性介质DMF为溶剂，采用微波辅助技术，400W，辐射15min，收率可达到98%。相比较真空热解法，具有快速、节能、产率高的优点。

4）催化脱甲基化［35］。以盐酸小檗碱为原料，采用甲苯为溶剂，加入无水氯化铝，在110℃条件下，回流反应1h，可制取小檗红碱。该方法的优点是反应温度可显著降低，但是，仍然需要分离提纯。

5）置换脱甲基［36］。盐酸小檗碱与盐酸吡啶在160～170℃的油浴中搅拌加热至溶解，保温条件下，继续搅拌，混合物固化，冷却后，加无水乙醇溶解，过滤得到固体，溶于热水中，活性炭脱色，滤液加丙酮后，放置得到红色针状结晶。该反应可能是盐酸吡啶通过置换反应夺甲基生成甲基吡啶盐酸盐，该方法提纯精制过程繁琐，且收率低。

以小檗碱为原料，通过去甲基化得到小檗红碱是目前小檗红碱制备的主要技术路线，仅限于实验室研究，还没有工业化生产技术。该技术不仅佐证了中药炮制过程中小檗碱含量变化的情况，而且也证明了小檗碱与小檗红碱的可逆性制备［7］。但是，必须清醒地认识，该技术是以小檗碱为原料合成小檗红碱，不仅消耗了产量有限的小檗碱，同时也注定了增加了药物的成本。研究开发替代化学原料的小檗红碱的化学合成方法是未来研究的热点。

2 衍生物与药理作用

目前，对小檗红碱的代谢过程及动力学研究表明［7，10，11，37-39］，小檗红碱在人体内可快速吸收，且分布在肾、肝、脾和心等脏器，可经过肝与肾代谢。一定剂量的小檗红碱对肾脏呈现毒性，但是，C-9位的糖脂化物无毒，这也为小檗红碱C-9位衍生物的合成及应用提供了理论依据。随着小檗红碱的药理作用研究发现［40］，其抗肿瘤作用、降血脂血糖作用、抗微生物作用、抗炎作用、对心血管系统的作用以及抗氧化作用引起了广泛的关注，而且，小檗红碱的衍生物表现出优于小檗红碱本身的临床医疗效果，尤其对小檗红碱的C-9位的修饰改性成为了研究热点［41-48］。

2.1 C-9-O-衍生物

2.1.1 亲油性

1）抗癌活性。以真空裂解小檗碱得到的小檗红碱为原料，在乙腈溶液中，碱性条件下与氯苄回流反应合成9-O-苄基化合物，通过常规的倍半稀释法和MTT法分别进行抗菌和细胞毒实验表明［49］，衍生物的活性有所提高，抗菌活性比小檗碱提高30倍，含氯素苄基引入后活性更强，对人肺癌和人宫颈癌细胞的增殖有较强的抑制作用。将萜烯基引入C-9-位生成9-O-萜烯基小檗碱［50］，表明亲油性基团的引入，表现出对癌细胞的生长的抑制性和活性。

2）抗菌抗炎活性。以氮气保护热解小檗碱得到的小檗红碱为原料，在乙腈溶液中，与4-氯丁氧苯反应得到9-苯氧丁基小檗碱，体外抑菌实验表明［51］，对常见致病菌体现了良好的抗菌活性，对耐药产气菌的效果最佳，其次是大肠杆菌、痢疾杆菌、链球菌和耐甲氧西林金葡菌，其抗菌效果其中对耐药产气菌和大肠杆菌的抑制作用最为明显，与小檗碱相比提高了16倍。将甲硝唑与苯三唑引入 C-9-位［52，53］，均表现出较好的抗菌性作用。将含有CF3—，NO2—，CN—等基团的甲苯引入C-9-位［54］，表现出较高的抗菌和抗真菌活性，作用机制为衍生化合物通过氢键、π-π，π-阳离子、π-阴离子等与目标DNA紧密键合。

3）动脉粥样硬化。采用高温真空条件下，选择性脱出9-位甲基，在碱性条件下，以酯键、酰胺键等作为连接臂，在小檗红碱的9-位引入短链烷基、刚性基团、杂环以及取代芳环等不同类型取代基，涉及合成多个衍生物。对其抑制由白细胞介素（IL-6）诱导的转录激活因子（STAT）的磷酸化进行研究表明［55］，9-位刚性基团的引入有利于活性的提高，通过抑制过程磷酸化，进而抑制介导的炎症反应，为新型抗动脉粥样硬化候选药物提供了良好的构效关系和科学依据。

4）阿尔兹海默症。将邻苯二酚和对苯二酚引入C-9-位［56］，其衍生物表现出优异的抗氧化活性以及淀粉样蛋白的Aβ聚集，其中邻苯二酚衍生物表现出优异的阿尔兹海默症治疗效果。将含氮苯环引入C-9-位［57］，其衍生物具有较好的抗胆碱酯酶活性与抗炎活性，是有潜力的抗阿尔兹海默症化合物。将环己基氨基和烷基苯酚引入C-9-位［58，59］，其衍生物与乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的动力学以及分子模拟研究表明，两者的对接模式是通过催化活性位与外围阴离子位点连接的。将噻吩以及氟代苯甲酰基团引入C-9-位［60］，其衍生物对逆转录酶的抑制活性研究表明，修饰的小檗碱具有抗HIV活性，且毒性较小。

5）降脂降糖。将亲油性基团，如烷基醇、芳基醇等引入C-9-位［61］，构建系列酯类或者醚类活性化合物。研究表明酯类（棕榈酸酯）的引入有明显的降胆固醇作用，可作为安全的口服降脂药物，并且可提高口服小檗红碱的生物利用度。将肉桂酸引入C-9-位［62］，生成肉桂酸小檗碱酯，显著提高了低血糖症活性，可作为可开发的新型抗2-型糖尿病药物。

2.1.2 亲水性

对小檗碱的C9位进行亲水性修饰，合成了9-O-小檗碱糖苷同系物。对SD大鼠灌胃给药实验表明［63］，9-O-小檗碱糖苷同系物在口服生物利用度方面与小檗碱相比有显著的优势，为小檗碱的9.3倍。对大鼠灌胃给药9-O-小檗碱葡萄糖苷，结果表明［64］，9-O-小檗碱葡萄糖苷具有明显的体内降血糖与调节葡萄糖代谢异常能力。

2.1.3 二聚体

通过小檗红碱与6-海藻糖单对甲基苯磺酸酯和6，6’-海藻糖双对甲基苯磺酸酯的反应得到单联和双联衍生物。采用荧光光谱实验分析其与DNA作用发现［65］，单联体衍生物与DNA的结合能力与小檗碱相当，而双链体衍生物与DNA的结合能力比小檗碱提高了约7倍。由聚四乙二醇醚将两个小檗红碱链接得到二聚体［66］，在二聚体与铜离子配比为1∶1时，通过先插入DNA使其多醚链形成具有金属离子配位能力的构型，然后与铜离子形成对DNA具有断裂功能的活性中心。对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的作用研究表明［67，68］，可形成双抑制位点，显著提高其抑制作用。将黄芩黄素引入C-9-位［69］，形成小檗碱与黄芩黄素的偶联体，等同于二聚体联合两个药的效果，具有降脂防聚集作用，是潜在的肥胖治疗药物。研究表明［70-73］，二聚体或者偶联体衍生物与DNA之间的作用均比单体的小檗碱或者小檗红碱有所增强。

2.2 C-12，13-衍生物

2.2.1 C-12-

将氨甲基引入小檗红碱的C-12-位［74］，抗糖尿病活性的增强表明有利于2-型糖尿病的控制与治疗。以正丁烷为溶剂，将咪唑与甲醛在110℃，进行小檗红碱的 C-12-位修饰［75］，通过其与DNA作用研究表明具有较强的抗菌活性。将小檗红碱进一步还原为四氢小檗红碱，继续在其C-12-位引入苯并咪唑基团，其衍生物与DNA作用研究表明［76］，含氟苯并咪唑基团抗菌和杀真菌活性最好。

2.2.2 C-13-

以小檗碱为原料，在甲苯溶液中，采用氯化铝催化法，回流条件下去甲基得到小檗红碱。分别在小檗红碱的8、13位引入乙酰基、苄基和（3′，5′-二硝基）苄基得到不同的小檗红碱衍生物。对金黄色葡糖球菌、白色念珠菌、鲁西特念珠菌、克柔念珠菌和隐球菌的抗菌实验表明［35］，在小檗红碱的13位引入苄基的化学结构修饰，能够显著提高抗菌活性，可能是修饰的产物具有更高的新脂性，可增强细胞膜的渗透性。在C-13-位引入4-异丙基苯基团或者叔丁基苯基团［77，78］，都表现出较强的抗菌活性，且口服安全性相对较高。

在保留小檗红碱的异喹啉结构、二亚甲氧基、氮三角形结构以及C-9-甲氧基的同时，深入研究不同位置、不同基团的修饰与衍生，甚至二聚体或者偶联体的开发，尤其是结合已经证明有效的小分子作用基团的引入，都将是小檗红碱及其衍生物未来开发和研究的热点。