马铃薯多酚氧化酶新成员StuPPO9基因的分离鉴定及其过表达烟草遗传转化

张金辉，池明，*，Yu Xiang，王远宏，李二峰，刘慧芹，马睿

（1.天津农学院，天津300384；2.加拿大农业与农业食品部太平洋食品研究中心，萨莫兰不列颠哥伦比亚省V0H 1Z0，加拿大）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）属茄科一年生草本植物，块茎可供食用，是全球第四大重要的粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米。马铃薯又称地蛋、土豆、洋山芋等，茄科植物的块茎，与小麦、稻谷、玉米、高粱并成为世界5 大作物。马铃薯主要生产国有中国、俄罗斯、印度、乌克兰、美国等。中国是世界马铃薯总产最多的国家。2015 年，中国启动马铃薯主粮化战略，推进把马铃薯加工成馒头、面条、米粉等主食，马铃薯成为稻米、小麦、玉米外的又一主粮[1]。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是动植物和真菌中普遍存在的一类含铜氧化酶，PPO 催化内源酚类物质氧化为醌，醌再经过聚合形成色素，是引起马铃薯褐变的主要酶类[2-3]。

植物中多酚氧化酶通常由核基因编码，多基因控制，具有时空表达特性[4-7]。Thygesen 等[7]报道，马铃薯多酚氧化酶基因（PPO）包含5 个～6 个成员，POTP1/P2（GenBankID：M95196/M95197），POT32（U22921），POT33（U22922）和 POT72（U22923）[8]，它们均缺乏内含子结构。它们的核酸序列间享有70%～82%的同源性，属于组成型PPO 基因，具空间表达特性[9]。植物PPO 多定位于叶绿体类囊体腔或线粒体中[10-11]。而金鱼草（Antirrhinum majus）PPO 不具转运肽结构，定位于液泡[12]。典型的PPO 包含3 个结构域：N 末端的转运肽，中部高度保守的Cu 结合区和C 末端疏水结构区。高度保守的铜结合区包含CuA 和CuB，负责铜与氧分子及酚类底物的协调联动[13-15]。马铃薯PPO 功能的研究主要集中在与经济指标相关的酶促褐变反应上[16]。工业中，常使用酶活性抑制剂[17]和物理法[18-19]使PPO 活性降低甚至丧失。科研中，常采用转基因的方法将正义、反义或双链RNA 转入植物抑制PPO 基因表达，减少褐变的发生[20-23]。

本试验通过检索马铃薯基因组数据获得马铃薯所有PPO 成员，并对成员基因StuPPO9 进行分离鉴定、表达载体构建和烟草遗传转化，为后期基因功能的研究提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“大西洋”品种马铃薯：天津天兴佳业科技有限公司；离心柱型植物总RNA 提取试剂盒、离心柱型Plant Genomic DNA Kit、pEASYR-T3 Cloning Kit 克隆试剂盒：天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GoScriptTM反转录系统：Promega 生物技术有限公司；Eppendorf 冷冻离心机：德国艾本德生命科学有限公司、Bio-rad 梯度PCR 仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司、限制性内切酶BamHI 和PstI（NEB）和pCambia2301-ky 载体：北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 马铃薯中PPO 类似基因的检索

搜索GenBank 中已被确认的马铃薯PPO 基因信息，包括 StuPPO1（GenBank ID：15M95196/ M95197）、StuPPO2 （U22921）、StuPPO3 （U22922） 和 StuPPO4（U22923）。利用 US Joint Genome Institute 库，在马铃薯基因组序列中，选择blastn 系统默认参数，根据上述已知基因序列对 PPO 类似基因进行搜索。手动检查BLAST 得到的结果，并查找PPO 类似基因序列。使用NCBI BLAST platform、Vector NTI Advance 11 software和Simple ModularArchitecture Research Tool 等软件对得到的序列进行分析和整理。

1.3.2 StuPPO9 基因引物的设计与合成

运用Primer 3（version 0.4.0）引物设计软件，从GenBank 和HarvEST 库中搜集下载数据，并从获得的数据中得到特异核苷酸序列区域进行设计。特异性引物如下：

STPO-F（上游引物）：5′-ATGTTCATGAATACATCTCAAAC-3′

STPO-R（下游引物）：5′-CTAATCCTCAAGCACAATC-3′

扩增目的产物大小为1884bp，引物序列进行合成。

1.3.3 植物总RNA 提取

取大西洋马铃薯叶片用锡箔纸包裹置于液氮中，取200 mg 的冷冻样品组织，迅速放入研钵中研磨成细粉末状，RNA 提取过程遵循试剂盒（离心柱型）的步骤。提取的RNA 置于-80 ℃冰箱中待用。

1.3.4 第一条链cDNA 的合成

cDNA 的合成依照反转录试剂盒说明书进行，将得到的cDNA 放在4 ℃条件的冰箱中暂存。

1.3.5 gDNA 的提取

gDNA 的提取依照Plant Genomic DNA Kit（离心柱型）试剂盒说明书进行，将所得溶液收集到离心管中放在-20 ℃的冰箱中保存备用。

1.3.6 目的基因的PCR 扩增和克隆测序

利用StuPPO9 特异性扩增引物，分别以cDNA 和gDNA 为模板扩增目的基因。PCR 反应条件为：95 ℃预热 5 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；重复循环 30 次；72 ℃延伸10 min；恒温。PCR 扩增反应结束之后，产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，GoldView1 染色检测产物大小，再回收目的片段。扩增所得DNA 片段，按照pEASYRT3 Cloning Kit 载体说明书要求进行StuPPO9 基因的连接，转化Trans1-T1 感受态细胞，随后挑选出白色的阳性克隆，接种在LB 培养基上，于200 r/min，37 ℃培养6 h，菌液送公司测序。

1.3.7 过表达载体的构建

用限制性内切酶BamHI 和PstI 双酶将PCR 产物和pCambia2301-ky 载体的质粒进行双酶切并进行切胶回收，回收的目的片段用T4 DNA Ligase 与pCambia2301-ky 进行连接，16 ℃静置过夜，将连接产物转入到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，测序正确的重组载体命名为pCambia2301-StuPPO9。转化后的菌液均匀涂布在LB 固体培养基上，待完全吸收后，倒置平皿，37 ℃恒温培养约12 h。培养完成后，在LB 培养基中挑选最佳生长的白色阳性克隆，接种到50 mL 含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的 LB 液体培养基中，在 37 ℃下振荡培养12 h。随后依照重组质粒的提取方法操作，将得到的阳性转化子质粒提取后送往公司进行测序，确定序列正确后进行植株转化试验。

1.3.8 烟草的基因转化

应用烟草中农杆菌介导的转基因法[24]，将pCambia2301-ky 载体转入烟草中。转基因烟草株系首先在含有卡那霉素硫酸盐的培养集中筛选，随后进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）筛选。将卡那霉素硫酸盐和PCR 筛选阳性株系栽培于温室中。

2 结果与分析

2.1 基于基因组的马铃薯PPO家族基因分析

利用US Joint Genome Institute 基因组库，对马铃薯基因组检索，共检索到9 个PPO 相似基因，分别命名为StuPPO1 至StuPPO9。其中StuPPO5-9 是新检索得到的马铃薯PPO 基因。经过进一步分析发现，StuPPO1 至StuPPO8 均位于8 号染色体上，而StuPPO9则位于2 号染色体。StuPPO1 和StuPPO6 位置相邻，位于 47 kb 的一个区域内，而 StuPPO2、StuPPO3、StuPPO4、StuPPO5，StuPPO7 和 StuPPO8 则串联在长度为144 kb 的另一区域内。这两个区域在8 号染色体上间隔2 072 kb。与其他PPO 基因不同，StuPPO8 和StuPPO9 含有内含子结构见表1。

表1 马铃薯PPO 基因家族基因组分析Table 1 Genomic analysis of potato PPO gene family

续表1 马铃薯PPO 基因家族基因组分析Continue table 1 Genomic analysis of potato PPO gene family

根据核酸序列分析，StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4 间享有70%～82%的同源性，并分别对应先前报道的 POTP1/P2，POT32，POT33 和 POT72。EST库资料显示，StuPPO1-StuPPO4，在马铃薯不同发育期的组织中都有表达。StuPPO5-9 是新检索到的PPO 基因。其中StuPPO5-7 在EST 中的数据较少，没有发现StuPPO8。说明它们很可能在马铃薯中表达量很少或仅在特殊状态下诱导表达。

2.2 PPO蛋白区域和蛋白质特征的分析

采用SignalP 和iPSORT Prediction 在线分析软件预测9 个PPO 的亚细胞定位，发现除StuPPO2 和StuPPO4 存在线粒体转运结构域、StuPPO6 不具有转运肽结构外，其他PPO 基因均存在叶绿体转运结构域。各PPO 成员均包含高度保守的Cu 结合区。对PPO类似基因编码的氨基酸序列的分析，表明上述基因编码的氨基酸都含有3 个典型PPO 蛋白区域：酪氨酸酶区域（pfam00264），PPO1-DWL 区域（pfam12142）和PPO1-KFDV 区域 （pfam12143），StuPPO5 和 StuPPO7的酪氨酸区域比其它PPO 基因的短。StuPPO1-9 蛋白的区域名、重复序列和蛋白质特征见表2。

表2 StuPPO1-9 蛋白的区域名、重复序列和蛋白质特征Table 2 Region names，repeats and protein profiles of the StuPPO1-9 protein

2.3 StuPPO9基因的分离和鉴定

以大西洋马铃薯叶片为试材，参考马铃薯基因组中StuPPO9 预测序列设计特异性引物，分别以反转录的cDNA 和gDNA 为模板进行克隆。以cDNA 为模板扩增后获得1 780 bp 的单一条带，挑取两个阳性菌落进行质粒的提取和测序，见图1。

结果表明，两个克隆序列完全一致，与XM_0063-47021.2 一致性为98.4%。经gDNA 为模板进行扩增和克隆，核实该基因存在一个104 bp 的内含子结构。

2.4 马铃薯StuPPO9基因的同源性分析

运用 MEGA7.0 软件对番茄 PPO A、PPO E、PPO F、PPO D、PPO B[8]和马铃薯 StuPPO1-9 进行 DNA 序列同源性比对，并运用软件构建基因亲缘关系，结果见如图2。

图1 StuPPO9 基因克隆Fig.1 Amplification of StuPPO9 gene

图2 马铃薯与番茄PPO 基因序列进化树Fig.2 Potato and tomato PPO gene sequence evolution tree

结果表明，StuPPO9 与 StuPPO2、PPO D 的基因亲缘关系最远，与StuPPO4、PPO A、StuPPO3、PPO B、StuPPO6、PPO E、PPO F、StuPPO1、StuPPO5、StuPPO7 基因亲缘关系较远。其中，StuPPO8 和StuPPO9 因在茄科多酚氧化酶基因家族中含有内含子结构，而处于离其他PPO 较远的分枝中。

2.5 StuPPO9启动子的预测

根据Blast 及PlantCARE 在线软件分析，预测StuPPO9 基因起始密码子上游1 661 bp 的片段为启动子区域。该区域中TATA-BOX 和CAAT-BOX 分别位于所选序列的1 363 和1 317 位。采用PlantCARE 在线软件预测启动子区所包含的顺式元件。结果表明，在StuPPO9 基因启动子区主要包含3 类顺式作用元件：第一类是基础表达元件包括CAAT-box 和TATA-box，说明StuPPO9 启动子是一个典型的由RNA 聚合酶II结合的启动子；第二类是包括已经研究报道很多的病原诱导性顺式作用元件，如有GT-1 等，第三类是激素诱导反应顺式作用元件，如响应乙烯的ERE 元件，ABA 诱导相关的ABRE，响应MeJA 应答相关顺式作用元件CGTCA-motif、G-box 响应auxin 应答相关顺式作用元件TGA-element，参与抗病和水杨酸通路的GT-1 motif，环境诱导应答顺式作用元件LTR、HSE、I-box等，由此推测，StuPPO9 启动子可能是一个受生物因素和非生物因素诱导表达的启动子。

2.6 过表达StuPPO9载体的构建和烟草植株转化

利用StuPPO9 基因与Pcambia2301-ky 骨架重组克隆载体的大肠杆菌菌液为模板，结果见图3。

图3 基因连接载体转化菌落PCR 电泳图（A）、StuPPO9 过表达的烟草抗性芽（B）、烟草阳性株系的PCR 筛选（C）阳性烟草移栽收种（D）Fig.3 PCR-electrophoresis map of gene-ligated vectortransformed colonies（A），Tobacco-resistant buds（B）Screening of positive tobacco with overexpressed StuPPO9（C）and positive tobacco transplanting（D）

通过PCR 扩增后电泳检测结果如图3A 所示。由图可知，在2 000 bp 处显现出特异性条带与目标基因大小相符且为清晰、均一的电泳条带，表明目的产物与克隆载体成功连接。将带有StuPPO9 基因的pCambia2301-ky 载体，连接转化大肠杆菌。挑取1 个PCR 阳性的转化子进行质粒的提取。经测序分析确认后，转化农杆菌并侵染烟草外植体，诱导抗性芽的产生（图3B），通过PCR 筛选共得到5 个阳性株系（图3C），并进行移栽收种（图3D）。

3 结论

通过检索马铃薯基因组发现多酚氧化酶基因数目多于先前报道的5～6 个成员，StuPPO5-9 是新检索到的PPO 基因。对马铃薯正常植株叶片的StuPPO9 进行分离和鉴定，得到长度为1 884 bp 的序列片段，该片段中含有一段长为104 bp 大小的内含子，该基因与XM_006347021 的一致性为98.4%。与其他成员不同，它位于2 号染色体上，其启动子可能被生物和非生物因素诱导激活。利用农杆菌介导的基因过表达技术，将该基因转入烟草中，通过PCR 检测获得了5 个阳性株系。