miR-21与多发性骨髓瘤患者预后的关系及其对化疗耐药的影响和机制

程灵灵，魏晓晶，庄婧，刘莉莉 ，石林,任翠爱

1 潍坊医学院研究生院，山东潍坊261000；2 中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所；3 广西医科大学第一附属医院；4 潍坊市人民医院

近年来，多发性骨髓瘤(MM)的发病率呈逐年上升趋势，尽管来那度胺、沙利度胺和硼替佐米等新药的应用明显提高了临床疗效，但是仍有部分患者预后较差，耐药是MM患者生存预后差的主要原因[1,2]。miRNA是长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对原则，部分或完全与靶基因mRNA结合促使其降解或抑制其翻译过程，从而在转录后水平调节基因表达。研究发现，miRNAs可以调节癌基因和抑癌基因的表达水平，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[3,4]。miR-21在实体瘤或血液系统恶性肿瘤中表达普遍升高，是最早发现的发挥癌基因作用的miRNA之一。miR-21降低肿瘤细胞对多种化疗药物如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、曲妥珠单抗等敏感性[5～7]。2014年6～12月，我们观察了miR-21在MM患者骨髓细胞中的表达，分析其与患者预后的关系；并以人MM细胞ARP1为研究对象，探讨miR-21对MM细胞硼替佐米所致耐药性的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 骨髓组织标本与人MM细胞 收集2014年6～12月来中国医学科学院血液病医院淋巴瘤诊疗中心就诊的36例MM患者的骨髓标本，男20例、女16岁，年龄(54.8±10.2)岁，无疾病进展生存期(PFS)为(46±12)月，总生存期(OS)为(82±44)月。选取13例健康供者(骨髓移植健康供者，实验室检查后废弃标本)的骨髓标本，男8例、女5岁，年龄(45±7)岁。两者性别、年龄具有可比性。所有取材经过本院医学伦理委员会同意，受试对象均签署知情同意书。MM细胞ARP1购自美国典型培养物保存中心(ATCC)。

1.1.2 主要试剂与仪器 胎牛血清(FBS)、青/链霉素、DMEM和RPMI1640购自GIBICO公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Novartis公司；MM细胞标志蛋白CD138购自德国美天旎公司；蛋白定量试剂盒购自Thermo Scientific公司。CCK8购自同仁公司；抗c-Myc抗体购自 CST公司；抗Aurora A抗体购自Abcam公司。miR-21模拟物、miR-21阴性对照序列、Lenti-PacTMHIV慢病毒包装体系、All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒均购自GeneCopoeia公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人骨髓组织中MM细胞的分离 先以密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，再以每5×106个细胞中加90 μL PBS制成细胞悬液；每5×106个细胞加CD138磁珠10 μL ，4 ℃孵育15 min，过柱分离CD138阳性浆细胞。

1.2.2 人骨髓组织中MM细胞miR-21检测 采用实时荧光定量PCR法 TRIzol法提取人骨髓组织中MM细胞总RNA，采用Nanotrop2000超微量分光光度计测定总RNA在260～280 nm处的吸光度(A)，A260/A280在1.8～2.0，纯度尚可。采用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒,反转录合成cDNA；以U6为内参照，用实时定量PCR检测RNA丰度。以2-ΔΔCt计算miR-21相对表达量，重复3次取平均值。

1.2.3 ARP1细胞培养与miR-21转染 将ARP1细胞接种于含10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。将对数生长期的ARP1细胞接种6孔板，3×105/孔；按照Lenti-PacTMHIV慢病毒包装试剂盒使用说明书，将miR-21模拟物和miR-control质粒转染ARP1，48 h后在荧光显微镜下观察细胞生长情况和荧光情况。在荧光显微镜暗视野下可见绿色荧光，且转染率达90%以上；按1.2.2方法检测miR-21模拟物和miR-control干扰后ARP1细胞miR-21相对表达量分别为9.87±0.13、1.02±0.08，差异有统计学意义，将成功转染miR-21模拟物、miR-control质粒的ARP1分别命名为ARP1-OE细胞和ARP1-EV细胞。

1.2.4 miR-21对ARP1细胞化疗耐药性影响的观察 采用CCK8法。取对数期生长的ARP1-OE和ARP1-EV细胞，调整细胞密度为5×105/mL，以100 μL/孔接种6孔板；每孔中加入待测药物10 μL，设置化疗药物硼替佐米浓度为5 μmol/L，设置3个复孔。将培养板放在37 ℃、5% CO2的培养箱中,分别于孵育24、48、72 h时加CCK8溶液10 μL/孔，孵育2 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。实验独立重复3次，以空白对照组调零，计算细胞存活率。细胞存活率=实验孔平均吸光度/对照孔平均吸光度×100%。

1.2.5 miR-21对ARP1细胞c-Myc、Aurora A表达影响的观察 采用蛋白印迹法。取硼替佐米作用48 h的ARP1-OE和ARP1-EV细胞，用预冷的含蛋白酶体抑制剂的强RIPA细胞裂解液提取总蛋白；用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为1 μg/μL；每孔上样量20 μL,进行蛋白电泳，转膜。用5% TBST配制的脱脂奶粉封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min；加入二抗室温孵育2 h，TBST洗3次,每次10 min。以GAPDH为内参，PVDF膜化学发光显影，ImageQuant LAS4010成像分析仪拍照，以灰度比值表示c-Myc、Aurora A的相对表达量。

2 结果

2.1 MM患者和健康供者骨髓组织中MM细胞miR-21表达比较 MM患者骨髓组织中MM细胞miR-21表达水平1 153.97±424.06，高于健康供者的28.88±17.53(P<0.05)。

2.2 MM患者骨髓组织中MM细胞miR-21与预后的关系 miR-21高表达(miR-21表达≥平均值)的MM患者PFS为(45±15)月，短于miR-21低表达(miR-21表达﹤平均值)MM患者的(48±15)月，但差异无统计学意义；miR-21高表达的MM患者OS为(56±6)月，短于miR-21低表达MM患者的(94±16)月(P<0.05)。

2.3 miR-21对ARP1细胞化疗耐药性的影响 硼替佐米作用下，ARP1-OE细胞存活率均高于同时点的ARP1-EV细胞(P均<0.05)。见表1。

表1 miR-21对ARP1细胞硼替佐米耐药性的影响

注：与同时点ARP1-EV细胞比较，*P<0.05。

2.4 miR-21对ARP1细胞c-Myc、Aurora A表达的影响 硼替佐米作用48 h时，ARP1-OE细胞c-Myc和Aurora A表达水平高于ARP1-EV细胞(P均<0.05)。见表2。

表2 miR-21对ARP1细胞c-Myc、Aurora A表达的影响

注：与ARP1-EV细胞比较，*P<0.05。

3 讨论

MM是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常见血液系统恶性肿瘤，是一种浆细胞恶性增殖性疾病，以骨髓中单克隆浆细胞异常增生并分泌单克隆免疫球蛋白为特征。MM常伴有多发性溶骨性损伤、高钙血症、贫血、肾脏损伤、细菌性感染等并发症。近年来，新药的应用明显提高了临床疗效，但是患者预后仍然较差，肿瘤耐药是MM治疗失败的关键因素。

随着人们对miRNA研究的逐渐加深，人们明确认识到miRNA可以调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。在癌症相关miRNA的研究中，miR-21在实体瘤或血液系统恶性肿瘤中表达普遍升高。研究表明，miR-21与多种肿瘤的化疗耐药有关[8～10]。Deng等[8]发现，miR-21在结肠癌HT-29细胞中表达升高，并增加癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性；抑制miR-21的表达可降低5-氟尿嘧啶的IC50，增强结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。Gaudelot等[9]发现，miR-21在肾细胞癌耐药机制中发挥作用，抑制miR-21表达可明显降低多种耐药基因的表达水平，增加肾细胞癌对紫杉醇、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和多维替尼等化疗药物的敏感性。Chen等[10]发现，miR-21在耐药的肝细胞癌中表达水平明显较高，过表达miR-21可直接靶向FASLG降低其转录和翻译，明显降低肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性。研究表明，高表达的miR-21在肝细胞癌、胃癌、舌癌、胰腺癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中介导耐药[6,10～13]。

本研究结果显示，与健康供者相比，miR-21在MM患者的表达水平升高；且miR-21高表达的MM患者OS明显缩短，与之前的研究结果相一致[8～10]；但由于样本量不足，miR-21表达水平高的MM患者PFS较短，但其差异无统计学意义，后期我们会继续扩大样本量进行统计学分析。构建miR-21过表达的MM细胞株，发现miR-21过表达可降低MM细胞对硼替佐米的敏感性，提示miR-21可调节MM对硼替佐米耐药。

为进一步探究miR-21在MM患者耐药中发挥作用的机制，本研究经过TargetScan、miRBase和miRTarBase等数据库预测miR-21的靶基因，发现3个数据库共有的靶基因包括Aurora A和c-Myc。c-Myc基因属于Myc调节基因家族，编码必要的核转录因子，主要调节细胞生长、增殖、分化和细胞周期等[14]。在肿瘤细胞中，c-Myc过表达会激活一些下游基因的表达，导致DNA合成增加，促进细胞周期，增加染色体畸变发生率，最终导致基因组不稳定和化疗药物抵抗[15]。现有研究发现，c-Myc在舌癌、肺癌、结直肠癌和急性髓系白血病等多种肿瘤中过表达，增加肿瘤细胞的耐药性[16～18]。Aurora A是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在有丝分裂中发挥重要作用，如中心体的成熟和分离、两极纺锤体形成等。Aurora A在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。现有研究发现，Aurora A在非小细胞肺癌和乳腺癌中过表达，增加肿瘤细胞的耐药性，影响肿瘤患者的预后[19,20]。本研究发现，miR-21过表达的MM细胞中肿瘤相关耐药基因c-Myc和Aurora A表达明显增加。这提示miR-21可能是通过上调c-Myc和Aurora A表达，从而增加MM细胞对硼替佐米的耐药性。

综上所述，miR-21在MM患者的表达水平升高，miR-21高表达者OS明显缩短；miR-21过表达可降低MM细胞对硼替佐米的敏感性，该作用与其上调c-Myc和Aurora A表达有关。因此，我们认为miR-21可能是MM的潜在治疗靶点，靶向miR-21有可能改善MM对化疗药物的耐药性，改善MM患者的预后。