多柔比星对大鼠心肝肾及免疫器官的长期毒性作用

于靖，裴天仙

1天津市胸科医院，天津300051；2天津药物研究院新药评价有限公司

多柔比星(DOX)又称阿霉素，是从波赛链霉菌变种Streptomyces peucerius var. caesius发酵液中提取的一种蒽环类抗生素，属于细胞毒类抗肿瘤药，抗瘤谱较广，临床疗效高。DOX主要用于急性白血病、乳腺癌、淋巴瘤等的治疗[1～3]，一般为二线药物，可作为恶性淋巴瘤交替使用的首选药物。DOX虽然广泛用于治疗各种癌症，但毒性较大，长期使用可发生剂量依赖性的多器官毒性，这使其临床应用受到限制。目前从临床检验和毒理学角度，对DOX在多个脏器毒性作用的实验研究较少。2018年6～12月，本研究观察DOX对大鼠心脏、肝脏、肾脏及免疫器官的长期毒性作用，以期为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级SD大鼠48只，雄性，4～6周龄，体质量140～180 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK(京)2012-0001。DOX购自海正辉瑞制药有限公司，批号H33021980，将DOX用5%葡萄糖注射液充分溶解稀释至浓度为0.23、0.47、0.93 mg/L；5%葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司，批号A15033210-1；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)检测试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)公司。BD FACS AriaⅡ型流式细胞仪专用试剂购自美国BD公司；全自动生化分析仪c701购自德国罗氏诊断有限公司；FACS Aria Ⅱ型流式细胞仪购自美国BD公司；BX53普通光学显微镜、DP71病理显微摄影系统均购自奥林巴斯公司；梅特勒-托利多PL203电子天平购自广州沪瑞明实验仪器有限公司。

1.2 动物分组及给药 将48只SD大鼠随机分为溶剂对照组及DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组，每组12只，屏障系统饲养。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组分别给予0.23、0.47、0.93 mg/L DOX经尾静脉推注，给药体积30 mL/m2；溶剂对照组给予等体积的5%葡萄糖注射液经尾静脉推注，均缓慢匀速推注。每3周给药1次，共给药4次。给药结束，用20%乌来糖(4～6 mL/kg)腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血，剖取心脏、肝脏、肾脏、胸腺、脾及肠系膜淋巴结以备用。

1.3 血液生化指标检测 经大鼠腹主动脉取血3～5 mL，置于真空促凝采血管内，静置30 min，3000 r/min离心10 min，取上层血清备用，用罗氏全自动生化分析仪检测ALT、AST、CK、BUN、CRE。

1.4 大鼠外周血淋巴细胞亚群检测 EDTA抗凝全血100 μL，加入10 μL抗大鼠抗体CD3+-FITC、CD4+-APC、CD8+-PE、CD45RA-PE-Cy5，室温避光孵育20 min，加入红细胞裂解液2 mL，室温避光孵育10 min，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次。采用流式细胞仪参照试剂盒说明书计数CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞，计算CD4+/CD8+，并计数CD45RA+B细胞亚群。

1.5 脏器系数测定 实验结束后，称取大鼠体质量，剖取心脏、肝脏、肾脏、胸腺、脾和肠系膜淋巴结，用4%甲醛固定，以备组织病理学检查；剔除心脏、肝脏、肾脏、胸腺和脾脏附着的结缔组织和脂肪，精密称取质量，计算脏器系数，脏器系数=脏器质量/体质量×100%。

1.6 大鼠脏器组织病理变化观察 取大鼠心脏、肝脏、肾脏、胸腺、脾及肠系膜淋巴结置于4%甲醛固定液中，固定24～48 h，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色、透明和封固，于光学显微镜下观察各组织的病理变化[4，5]。

2 结果

2.1 DOX对大鼠血液生化指标的影响 与溶剂对照组比较，DOX 7.0 mg/m2组血液生化指标差异无统计学意义(P均>0.05)，DOX 14.0 mg/m2组AST、BUN、CRE高(P均<0.05)，DOX 28.0 mg/m2组ALT、AST、BUN、CRE高(P<0.05)；各组血清CK水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 DOX对大鼠血液生化指标的影响

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05

2.2 DOX对大鼠外周血淋巴细胞亚群的影响 与溶剂对照组比较，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群、CD45RA+B细胞亚群计数低，CD4+/CD8+高，DOX 14.0、28.0 mg/m2组外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群、CD45RA+B细胞亚群计数、CD4+/CD8+与溶剂对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 DOX对大鼠外周血淋巴细胞亚群的影响

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05

2.3 DOX对大鼠脏器系数的影响 与溶剂对照组比较，DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组大鼠心脏、肝脏、肾脏的脏器系数均高，胸腺、脾脏脏器系数均低。其中，DOX 14.0 mg/m2组的肝脏、肾脏、胸腺脏器系数及DOX 28.0 mg/m2组的各器官脏器系数与溶剂对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 DOX对大鼠各脏器系数的影响

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05。

2.4 DOX对大鼠各脏器组织的毒性作用 溶剂对照组心脏结构完整，心肌纤维排列整齐，横纹清晰，间质未见异常。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组可见不同程度的心脏病变，表现为心肌细胞空泡变性、坏死，部分伴有心耳血栓。溶剂对照组肝细胞索以中央静脉为中心排列整齐，细胞形态清晰，间质无异常改变。DOX 7.0、14.0、28.0 mg/m2组肝组织未见明显异常，DOX 28.0 mg/m2组可见肝细胞不同程度空泡变性。溶剂对照组肾脏皮髓质结构完整，肾小球、肾小管形态清晰正常，间质未见明显异常。DOX 7.0 mg/m2组肾脏组织未见明显异常，DOX 14.0、28.0 mg/m2组可见不同程度的肾病综合征表现：肾小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，部分见新月体形成；肾小管变性、坏死、再生、扩张、管型、基膜增厚；间质炎细胞浸润。溶剂对照组胸腺结构完整，皮髓质分界清晰，皮质内密集分布大量胸腺细胞。DOX 7.0 mg/m2组胸腺组织未见明显异常。而DOX 14.0、28.0 mg/m2组可见不同程度的胸腺萎缩，表现为皮质变薄，皮髓质分界不清晰，皮质内胸腺细胞减少乃至缺失。溶剂对照组脾脏由白髓、边缘区和红髓组成，结构完整清晰，红髓包含脾索和血窦。DOX 7.0 mg/m2组胸腺组织未见明显异常，DOX 14.0、28.0 mg/m2组可见不同程度的脾脏萎缩，表现为白髓淋巴细胞减少，其中边缘区减少更为明显。溶剂对照组肠系膜淋巴结见皮髓质结构完整，细胞形态清晰，淋巴小结增生活跃。DOX 7.0 mg/m2组胸腺组织未见明显异常，DOX 14.0、28.0 mg/m2组可见不同程度的淋巴结萎缩，表现为淋巴细胞减少。

3 讨论

DOX属蒽环类抗肿瘤抗生素，是具有代表性的细胞毒类药物，在肿瘤内科治疗发展历程中具有里程碑意义，已有50多年的应用历史。即使在靶向治疗、免疫治疗等新疗法不断涌现的今天，DOX仍然是很多实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤治疗的基础性药物[6]。DOX是由微生物产生的具有抗肿瘤活性的化学物质，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，但S期细胞对其最敏感。DOX可导致多器官毒性，可能的机制包括氧化应激、炎症、自由基的产生、DNA损伤、钙超载、细胞凋亡等，但最可能的机制是氧化应激[7，8]。

脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的质量与其体质量之比。正常时成年大鼠各脏器与体质量的比值比较恒定。动物发生毒性病变后，受损脏器质量可能发生改变，故脏器系数也随之改变。脏器系数增大，表示脏器充血、血栓、空泡变性(水样变、脂肪变或糖原沉积)、增生、肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。

心脏毒性是蒽环类药物最为严重的不良反应，蒽环类药物引起心脏毒性的主要机制为铁介导的活性氧簇的产生及促进心肌的氧化应激[9]。本研究发现，DOX各组心肌细胞变性、坏死，部分血栓形成，同时脏器系数升高，28.0 mg/m2组升高尤为显著，可见DOX有明显的心脏毒性，这与相关研究[10]结果一致。但心肌酶谱中CK在各实验组并未明显升高，其原因可能因为CK灵敏度较低，如果采用敏感度较高的肌钙蛋白和反映心肌张力变化的BNP或NT-proBNP来预测心肌细胞损伤，可能会出现不同的结果。因目前实验室所用试剂盒只能检测人血清，无法检测鼠来源血清，因此未对以上指标进行检测。

DOX主要在肝脏代谢，经胆汁排泄，有少量经肾脏由尿排出，因此其对肝肾功能的损伤也不容忽视。本研究发现，DOX 28.0 mg/m2组肝脏中肝细胞空泡变性，DOX 14.0、28.0 mg/m2组为肾病综合征，表现为肾小球空泡化，基膜增厚，系膜增生，肾小管变性、坏死和肾间质炎细胞浸润；另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2组肝脏和肾脏质量增加，脏器系数升高。可见，DOX有明显的肝肾毒性，有研究显示，DOX导致肝肾毒性的机制可能与凋亡、炎症和氧化应激有关[11]。

正常机体中各T淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体的免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，机体就可导致免疫功能紊乱并发生一系列的病理变化。胸腺是中枢免疫器官，内有大量的胸腺细胞，即分化发育的各期T细胞；脾脏和淋巴结是外周免疫器官，组织内的淋巴细胞包括B细胞和T细胞，其中脾脏内淋巴细胞中B细胞约占60%，T细胞约占40%；淋巴结以B细胞为主，T细胞主要分布在边缘区[12]。本研究结果表明，在外周血中，DOX 14.0、28.0 mg/m2两个剂量可致大鼠CD3+、CD4+、CD8+T细胞计数和CD45RA+B 细胞计数降低，CD4+/CD8+升高，机体免疫功能紊乱。另外，DOX 14.0、28.0 mg/m2组胸腺和脾脏较小，脏器系数明显降低。显微镜下发现，DOX 14.0、28.0 mg/m2组胸腺、脾脏、淋巴结发生不同程度的萎缩，表现为T和(或)B细胞减少。由此可见，14.0、28.0 mg/m2的DOX可致大鼠免疫器官萎缩，免疫功能降低。

综上所述，DOX作为一种临床常用的广谱抗肿瘤药物，其对大鼠心、肝、肾和免疫器官均有不同程度的毒性反应。但本研究只是初步观察了DOX的毒性作用，未对其致毒的机制进行深入探讨，这将是今后工作的方向和重点。