香附提取物在表柔比星促进三阴性乳腺癌细胞凋亡中的作用及机制

边梦雪，于志勇

1济南大学医学与生命科学学院，济南250117；2山东省医学科学院；3山东大学附属山东省肿瘤医院

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在女性新发癌症的发病率和病死率中均居首位[1]。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种异质性疾病，缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的表达。TNBC仅占所有乳腺癌的15%左右，是最具侵袭性的乳腺癌亚型之一[1]。虽然新的治疗方法如分子靶向治疗、免疫治疗等可改善部分TNBC患者的预后，但化疗仍占据着无可替代的地位[2]。影响化疗成败的关键因素之一是肿瘤细胞是否出现耐药。寻找联合应用的药物来克服肿瘤耐药性、降低化疗药物毒副作用可能是一种有效方法。香附为莎草科多年生草本植物莎草的干燥根茎，可单独作用于中枢神经系统、心血管系统、消化系统，有显著的神经保护、抗氧化、抗DNA损伤、抗菌和抗糖尿病等作用[3,4]。关于香附治疗乳腺癌的报道很少。研究发现，中药可有效控制肿瘤细胞的转移及术后复发[5]。香附乙醇提取物可诱导TNBC细胞株MDA-MB-231凋亡，其诱导细胞凋亡的机制尚不清楚[6]。自噬通过介导溶酶体依赖途径中的异常蛋白质和亚细胞器降解维持细胞内稳态。乳腺癌细胞耐药可能由于其自噬活性的增加。有研究证实，抑制自噬可改善非小细胞肺癌细胞化疗和靶向治疗之间的拮抗作用[7]。可见，抑制自噬可使耐药细胞恢复敏感性，增加化疗药物的细胞毒性。2019年4～6月，本研究选取TNBC细胞株MDA-MB-231，观察香附提取物处理后对表柔比星抗肿瘤效应的影响，探讨香附提取物应用于抗TNBC治疗的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 香附干品购自安徽协和成药业饮片有限公司。表柔比星购自美国辉瑞制药有限公司。MDA-MB-231细胞株购自上海细胞生物学研究所中国科学院细胞库。CCK-8试剂盒购自济南柠檬生物技术有限公司；兔抗人Actin、Bax、Beclin-1单克隆抗体、鼠抗兔IgG二抗均购自上海优宁维生物科技股份有限公司；RPMI-1640细胞培养液及胎牛血清购自江苏凯基生物技术股份有限公司。SpectraMax i3多功能酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司，Gel Doc XR+蛋白凝胶成像仪购自上海涵飞医疗器械有限公司，Calibur流式细胞购自上海普迪生物技术有限公司。

1.2 香附提取物提取 将香附干品切成小块，与95%乙醇以1∶10放入烧瓶中，室温下在暗室密封12 h，于80 ℃的水浴中加热2 h获得上清液1；加入与上清液1等量的95%乙醇，再次煮沸混合物2 h，得到上清液2，将提取的上清液2过滤，过滤的上清液2在 40 ℃下旋转蒸发器中干燥，冻干后得到棕黄色粉末，为香附乙醇提取物，在二甲基亚砜中再悬浮至400 mg/mL，稀释后滤器过滤，于-80 ℃冻存。

1.3 细胞培养及药物处理 将细胞接种于培养瓶中，于含有10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的培养箱，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养。细胞液每周传代2～3次，当细胞生长至融合度85%时，用0.25%胰蛋白酶消化。取对数生长期细胞进行实验。将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL,分别加入剂量为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mg/mL的香附提取物，0、0.75、1.5、3 μg/mL的表柔比星，香附0.4 mg/mL(接近半数致死量)+表柔比星1.2 μg/mL(接近半数致死量)处理48 h。

1.4 细胞增殖活力检测 采用CCK-8实验。药物处理48 h，收集细胞，加入CCK-8试剂10 μL，继续培养2 h，用酶标仪于450 nm波长处读取吸光度值。计算细胞存活率以及半数抑制浓度，细胞存活率(%)=加药组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.5 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。药物处理48 h，收集细胞，用胰蛋白酶收集，含血清培养基中和后离心(1 000 r/min，3 min)，用冷PBS洗涤2次，于缓冲液中再悬浮，加入AnnexinV-FITC、PI各5 μL，暗室孵育15 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡，计算细胞凋亡率。活细胞不能被AnnexinV-FITC、PI染色，早期凋亡细胞因卵磷脂酰丝氨酸暴露及有完整细胞膜，故呈AnnexinV-FITC染色阳性及PI染色阴性，晚期凋亡率细胞呈AnnexinV-FITC染色阴性及PI染色阳性。

1.6 细胞克隆形成率检测 采用细胞平板克隆实验。药物处理48 h，收集细胞，PBS冲洗2遍，换新鲜培养基，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周，弃上清液后用PBS清洗，每孔加入的Carnoy固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)2 mL固定20 min，然后用自来水慢慢洗净，每孔加入结晶紫染色液2 mL室温静置20 min，回收染液，冲洗干净后烘箱风干计数。

1.7 细胞内凋亡标志蛋白Bax、抗凋亡标志蛋白Bcl-2及自噬标志蛋白Beclin-1表达检测 采用Western blotting法。药物处理48 h，收集细胞，弃原培养基。将贴壁细胞用冷PBS在冰上洗涤，并在含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中裂解20 min。上清液于4 ℃以12 000 r/min离心20 min，并按照说明对上清液进行BCA定量，然后与蛋白上样缓冲液混合，100 ℃煮沸5 min，将提取的样品蛋白置于EP管保存于-80 ℃冰箱备用。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，100 V的电压转膜60 min转移到PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶将膜封闭1 h，1×TBST洗膜3遍，一抗BAX(2772T)、Bcl-2(4223T)、Beclin-1 (D40C5)、β-Actin (13E5)，稀释比例1∶1 000)于4 ℃下孵育过夜，以β-Actin为内参。次日TBST洗膜后在室温下与二抗goat anti-rabbit IgG(1∶5 000)孵育1 h。配置ECL发光液使用凝胶成像仪检测蛋白表达。使用Image J软件检测蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白电泳条带灰度值/内参蛋白电泳条带灰度值。

2 结果

2.1 香附提取物对MDA-MB-231细胞增殖的影响 经0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL香附提取物处理MDA-MB-231细胞48 h，细胞存活率分别为(95.08±5.36)%、(82.47±8.45)%、(69.10±7.25)%、(58.72±7.26)%、(47.00±6.38)%、(32.00±5.21)%。经0、0.5、0.75、1.5、2 μg/mL表柔比星处理MDA-MB-231细胞48 h，细胞存活率分别为(97.08±3.56)%、(73.27±8.45)%、(63.22±7.38)%、(56.72±5.16)%、(43.00±4.32)%。0.4 mg/mL香附提取物联合0、0.5、0.75、1.5、2 μg/mL表柔比星处理MDA-MB-231细胞48 h，细胞存活率分别为(96.18±.3.16)%、(63.21±8.35)%、(58.72±7.42)%、(52.32±5.23)%、(32.21±4.22)%。香附提取物联合表柔比星处理后，MDA-MB-231细胞存活率低于二者单独处理(P均<0.05)。

2.2 香附提取物与表柔比星对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 香附提取物+表柔比星处理后，MDA-MB-231细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均高于二者单独处理(P均<0.05)，见表1。

表1 香附提取物与表柔比星对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.3 香附提取物与表柔比星对MDA-MB-231细胞克隆形成的影响 经0.4 mg/mL香附提取物、1.2 μg/mL表柔比星、0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星处理后，MDA-MB-231克隆形成率分别为(65.32±6.41)%、(69.52±5.41)%、(45.68±8.31)%。经0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星处理后MDA-MB-231克隆形成率低于二者单独处理(P均<0.05)。

2.4 香附提取物与表柔比星对MDA-MB-231细胞内Bax、Bcl-2及Beclin-1蛋白表达的影响 经0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星处理后MDA-MB-231细胞内Bax蛋白表达高于二者单独处理，Bcl-2 、Beclin-1蛋白表达低于二者单独处理(P均<0.05)。见表2。

表2 香附提取物与表柔比星对MDA-MB-231细胞内Bax、Bcl-2及Beclin-1蛋白表达的影响

3 讨论

由于TNBC缺少内分泌治疗和靶向治疗的机会，易发生器官转移，预后差，化疗是治疗TNBC的主要手段[8]。表柔比星是治疗TNBC最有效的化疗药之一，主要通过破坏细胞核基因并干扰其转录翻译来杀死癌细胞，可与细胞中DNA发生共价或非共价结合而抑制肿瘤细胞的功能，作用强且效果快[9]。但肿瘤耐药性影响了TNBC的化疗效果。

中医药有着数千年的发展历史，越来越多的研究试图从中药中获取高效的抗肿瘤化合物。已有文献证实，香附提取液可以杀死不同的癌细胞，包括乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞Hepg2等[10]。从香附的乙酸乙酯提取物中分离得到的11,12-二羟基-4-烯-3-酮对卵巢癌细胞有显著的杀伤作用[11]。

本研究中香附提取物的主要成分为香附芳香酮、吲哚、异丙内酯混合物。香附提取物的总黄酮和乙酸乙酯提取物能抑制黄嘌呤氧化酶，防止脂质过氧化引起的dDNA损伤，诱导白血病细胞凋亡[12]。香附提取物可改善过氧化氢诱导的氧化应激，延长寿命，并减少神经元和年龄相关疾病[13]。从香附中分离到的6-乙酰氧基香附烯可引起卵巢癌细胞caspase依赖性凋亡[14]。在古代文献中，香附被磨成粉末，与姜汁、酒混合外敷治疗乳腺癌[15]。对于香附提取物治疗TNBC的研究较少，且作用机制并不明确。本研究结果表明，香附提取物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较强的细胞毒性，并诱导细胞凋亡。然而，香附提取物的加入增强了表柔比星的细胞毒性，联合用药后细胞凋亡率升高，克隆形成率降低。

本研究中香附提取物联合表柔比星处理的MDA-MB-231细胞凋亡标志蛋白Bax表达升高，抗凋亡标志蛋白Bcl-2表达减少。Bcl-2与其同源结构域(BH3)结合，在调控细胞凋亡中发挥重要作用。通路起始于BH3蛋白的诱导或激活，这有助于Bcl-2的失活以及激活Bax、BAK，Bax和BAK被激活，线粒体分裂增加，Caspase依赖的凋亡被激活[16]。部分化疗药物和靶向治疗可以诱导细胞自噬，从而保护细胞免受药物诱导的DNA损伤，维持细胞内稳态，促进细胞存活。表柔比星可诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生自噬[17]。有研究报道，香附提取物诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其机制与活性氧产生及磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、促分裂原活化蛋白激酶途径无关，对其凋亡机制也未进一步研究[18]。本研究中香附提取物联合表柔比星处理后MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达降低。提示香附提取物可能通过抑制细胞自噬增强表柔比星对MDA-MB-231细胞的毒性作用。香附提取物在体外诱导TNBC细胞凋亡，作为自噬抑制剂可增强表柔比星药物毒性。这为用香附提取物作为自噬抑制剂克服自噬耐药和增强表柔比星对TNBC的抗癌作用提供了证据。

本研究在体外实验阶段初步验证了香附提取物促进表柔比星引起的细胞凋亡，但其确切的作用机制及效果需进一步进行体内实验加以验证。