海南白唇竹叶青线粒体基因组结构与特征分析

2020-02-21王湘君林炽贤唐海丽

野生动物学报 2020年1期

王湘君陈文林炽贤唐海丽，3

(1.海南热带海洋学院水产与生命学院，两栖爬行动物研究省级重点实验室，三亚，572022；2.海南热带海洋学院理学院，三亚，572022；3.三亚二中，三亚，572099)

1 前言

竹叶青蛇属(Trimeresurus)，属于有鳞目(Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝮亚科(Crotalinae)，广义竹叶青蛇属，目前国际公认共37个物种[1]。据《中国动物志》记载[2]，中国分布有6种竹叶青蛇属蛇类，其中海南岛分布有两种，即白唇竹叶青蛇(Trimeresurusalbolabris)和福建竹叶青蛇(海南亚种)(Trimeresurusstejnegerihainanensis)。白唇竹叶青蛇是竹叶青蛇属中分布最广的一种，主要分布在东亚和东南亚[3]，海南岛的白唇竹叶青蛇并未被定为亚种[2]。研究其线粒体基因组，有利于进一步研究其分类、进化、扩散等[4-5]，希望此研究能提供一个有用的数据库以分析蝰科毒蛇的系统发育关系[3，6-9]。

Song等[3]和Zhu等[6]，以及Lin在NCBI上提交的序列[10]分别对白唇竹叶青蛇、四川竹叶青蛇(Trimeresurussichuanensis)和福建竹叶青蛇的线粒体全序列做出了分析。但文中并没有提到白唇竹叶青蛇和福建竹叶青蛇的标本产地。

原矛头蝮属(Protobothrops)蛇类也隶属于广义竹叶青蛇属，与竹叶青蛇属亲缘关系很近。Huang 等、Zhang 等、Kang等[7-9]对多种原矛头蝮属蛇类的线粒体基因组也做出了分析，丰富了GenBank数据库。

作者拟对海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组进行测序，分析其基因和碱基的组成，并与近缘物种进行比较其差异性，以丰富线粒体基因组数据库。

2 材料与方法

2016年于海南省乐东县采得竹叶青蛇样本一号，根据形态学特征，进行初步鉴定。取其新鲜个体的肝脏，保存于95%乙醇，送至北京六合华大基因科技公司进行DNA提取和线粒体全序列测定。

表1 PCR反应条件

Tab.1 Reaction requirement for PCR

运用 DNASTAR 软件包里的 Seq Builder 做全序列的基因组结构图，利用 Editseq 对碱基含量进行计算。GC 偏斜值根据 Pema 和Kocher1995 年所定义的公式[11]：GC-skew=(G-C)/(G+C)计算，AT 的偏斜值也用类似的方法计算。GC 的含量越高，偏斜值越小[12]。运用 DNAstar 软件对选取的全序列进行碱基含量分析。

将全序列放入NCBI，运用BLAST功能(nucleotide to nucleotide)进行比对，确定为白唇竹叶青蛇。并与近缘物种(竹叶青蛇属、原矛头蝮属)物种进行比较。

3 结果与分析

3.1 结果

据《中国动物志》记载[2]，海南岛分布有2种竹叶青蛇，即福建竹叶青蛇和白唇竹叶青蛇。作者根据所获标本的外部形态，第一上唇鳞和鼻鳞仅有不完全鳞沟，初步鉴定为白唇竹叶青蛇。

测得目标个体线粒体基因组全序列长度为17 222 bp，为环状闭合DNA，如图1所示。

与其他蛇类基因相似，包括 13个蛋白质编码基因，22个tRNA、2个rRNA、2个控制区(D-loop)和轻链复制起始区(OL)，与其他已经报道的脊椎动物线粒体基因结构相同。除ND6亚基基因和L链上编码的8个tRNA基因外，其余基因均分布在H链上。主要特征如表2。

图1 海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组结构Fig.1 Organization in the mitochondrial of of T.albolabris from Hainan island

表2 海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组结构和特征

Tab.2 The mitochondrial genome structure and characteristics of T.albolabris from Hainan island

H=Heavy strand，重链；L=Light strand，轻链

3.2 分析

其线粒体基因组全序列的碱基中，A的含量为33.4%，C的含量为27.3%，G的含量为12.3%，T的含量为27%。此测定结果其中，A+T的含量(60.4%)明显高于G+C的含量(39.6%)，AT的偏斜为0.11，GC的偏斜为-0.38，即AT的偏斜大于GC，这与脊椎动物线粒体DNA的L链碱基组成一致[13-14]。A的含量明显偏高，而G明显偏低，与其他蛇类此片段碱基组成比例相当[15-19](表3)。

表3 海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组碱基含量

Tab.3 The nucleotide content of mitochondrial genome of Trimeresurus albolabris from Hainan island

注：AT skew=(A-T)/(A+T)，GC skew=(G-C)/(G+C)

4 讨论

此序列与NCBI上编号为KF311102的白唇竹叶青蛇总相似度为99.61%[3]；文中并未提到采集地点；根据文中的项目基金，作者推测采集于安徽。

此序列与编号为FJ752492的福建竹叶青蛇总相似度为89.37%[10]，因此可以进一步确认其为白唇竹叶青蛇。与编号为KT266810的四川竹叶青蛇总相似度为88.33%[6]，该两号标本分别采集于四川省合江县和贵州省江口县。

4.1 线粒体各区域基因

4.1.1 蛋白质编码基因

海南产白唇竹叶青蛇线粒体上的13个蛋白基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、ATP6、ATP8、COX1、COX2、COX3、Cytb)的长度范围为67—1 788 bp，总长度是17 222 bp，占全序列的60%。所有基因的起始密码子均为ATG。COXIII、Cytb基因的终止密码子为不完全终止密码子T，ATP8、ATP6基因的终止密码子都为TAA。

4.1.2 核糖体RNA基因

海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组包含2个核糖体RNA基因，分别为12S rRNA和16S rRNA，两者之间由tRNA-Val基因隔开。12S rRNA基因的长度为907 bp，16S rRNA基因的长度为1 477 bp，12S rRNA基因的碱基中，A的含量为36.8%，C的含量为25.1%，G的含量为17.0%，T的含量为21.1%，A+T的含量为57.9%，G+C的含量为42.1%，GC的偏斜为-0.19，AT的偏斜为0.27；16S rRNA基因的碱中，A的含量为22.8%，C的含量为22.6%，G的含量为14.1%，T的含量为22.8%，A+T的含量为61.4%，G+C的含量为36.7%，GC的偏斜为-0.23，AT的偏斜为0.26。两者碱基含量的差别很小，说明两者存在相似的进化率。

4.1.3 转运RNA基因

海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组全序列包含22个tRNA基因(tRNA-Phe、tRNA-Val、tRNA-Leu(UUR)、tRNA-Ile、tRNA-Gln、tRNA-Met、tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(UCN)、tRNA-Asp、tRNA-Lys、tRNA-Gly、tRNA-Arg、tRNA-His、tRNA-Ser(AGY)、tRNA-Leu(CUN)、tRNA-Glu、tRNA-Thr、tRNA-Pro)，长度范围为55—343 bp，总长度为1 734 bp，碱基中A的含量为33.89%，G的含量为17.26%，T的含量为24.94%，C的含量为23.89%，A+T的含量为0.16，G+C的含量为-0.15。

4.1.4 非编码区域

海南产白唇竹叶青蛇线粒体基因组全序列的非编码区域包括控制区(D-loop)和轻链复制起始区(OL)。D-loop区位于tRNA-Phe和tRNA-Thr之间，长度为1 067 bp，A的含量为27.3%，C的含量为25.5%，G的含量为12.0%，T的含量为35.2%，A+T的含量为62.5%，G+C的含量为37.5%。A+T的含量远大于G+C的含量。O区位于tRNA-Asn和tRNA-Cys之间，长度为33 bp。

4.2 与福建竹叶青蛇线粒体基因组比较

据《中国动物志》记载，海南产竹叶青蛇有两个物种，即白唇竹叶青蛇与福建竹叶青蛇，海南产福建竹叶青蛇命名为福建竹叶青蛇海南亚种(T.s.hainanensis)。

白唇竹叶青蛇线粒体基因组全序列的长度为17 222 bp，NCBI上公布的福建竹叶青蛇(T.stejnegeri，FJ752492)线粒体基因组全序列的的长度17 239 bp[6]两者相差17 bp，相似度为89.37%。蛋白质编码区的长度范围为11 300—11 362 bp，G+C碱基含量范围为39.05%—39.59%；核糖体RNA基因的长度范围为2 384—2 399 bp，该部分的变化范围较大，G+C碱基含量范围为39.4%—41.4%；转运RNA基因的长度范围为1 456—1 734 bp，G+C碱基含量范围为39.05%—39.59%；D-loop区基因的长度范围为1 062—1 067 bp，G+C碱基含量范围37.2%—37.5%。

白唇竹叶青蛇线粒体基因组全序列的碱基与福建竹叶青蛇相比，A的含量多0.3%，C的含量少0.9%，G的含量为少0.3%，T的含量多1%。白唇竹叶青蛇A+T的含量(60.4%)大于G+C的含量(39.6%)，福建竹叶青蛇A+T的含量(59.1%)大于G+C的含量(40.8%)。因此白唇竹叶青蛇A+T的含量比福建竹叶青蛇多1.3%，G+C的含量少1.2%。

福建竹叶青蛇的AT偏斜值为0.12，GC偏斜值为-0.38，GC的偏斜的绝对值大于AT的偏斜值；白唇竹叶青蛇GC偏斜值为-0.38，AT的偏斜值为0.11，GC的偏斜的绝对值也是大于AT的偏斜值。

4.3 与原矛头蝮线粒体基因组比较

GenBank上与作者测得序列相似度最高的序列，还有10个物种，49个个体原矛头蝮属蛇类线粒体基因全序列，其相似度大于85%[10](表4)。

表4 白唇竹叶青蛇与原矛头蝮属蛇类线粒体基因组的相似性

Tab.4 The similarity of mitochondrial genome between T.albolabris and Protobothrops app.

由于与核DNA相比，线粒体的体积小、母体遗传、突变率加快，并且很少或根本没有重组，线粒体基因组序列已被证明在几个分类水平上对系统发育关系有用[20]。本研究结果有助于濒危物种遗传资源的保护，有助于毒蛇的遗传鉴定和系统发育研究[21]，希望为分析海南产白唇竹叶青蛇和其他毒蛇的系统发育关系提供一个有用的数据库。