生物技术生产丁酸的研究进展

王杰明, 石雅丽,2*, 刘安礼, 刘占英,2, 兰辉, 郝健霞, 姚梽鹏, 张清翠

1.内蒙古工业大学化工学院食品与生物工程系, 呼和浩特 010051;

2.内蒙古自治区发酵产业节能减排工程技术研究中心, 呼和浩特 010051

丁酸(butyric acid)作为一种重要的化工原料,已经大量的应用于民生行业中。在食品领域，丁酸及其衍生物作为食品添加剂可直接添加到食品中，以增强食品的风味，比如，丁酸酯可以产生诱人的香味，在食品中被广泛用作香料；丁酸钠是一种新型的饲料添加剂，正在逐步替代传统的抗生素类添加剂[1]。在医药领域，丁酸作为一种短链脂肪酸，它是人类和其他许多哺乳动物肠道上皮细胞的首选能源物质，因此它对维持和促进肠道正常功能起着重要作用，所以丁酸对肠炎有很好的治疗作用；同时，丁酸能阻止组蛋白脱去乙酞基团，所以它可以防止癌细胞的扩增，具有抗癌的作用。此外丁酸因微生物对其不具备抵抗力故有望代替传统的土壤熏蒸剂[2]。

目前，工业上生产丁酸主要以石油为原料进行化学合成，但由于当今世界原油供应存在不稳定性和不可持续性的问题，使得丁酸生物技术发酵法引起了人们的密切关注。与化学法相比，生物发酵法的优势有以下几点：所使用的原材料比较广泛，发酵过程属于典型的厌氧过程，低能耗、对环境的污染较低，以及可持续加料生产丁酸等。因此，使用微生物发酵生产丁酸日益受到重视[1]。

1 丁酸的性质

丁酸，化学结构式为CH3CH2CH2COOH，分子量为88.11 g·mol-1，熔点为-7.9 ℃，沸点为163.5 ℃，无色至浅黄色透明油状液体，有刺激性气味，属于典型的低级挥发性脂肪酸。因为丁酸可溶于水和部分有机物，可伴随水蒸气挥发，而且能与水形成共沸物，因此可以用液相色谱法对其进行定性及定量检测。

2 产丁酸菌株的特点

目前，产丁酸菌至少有10个属，其中有7个属已进入工业应用，它们都是厌氧微生物。其中，梭菌属(Clostridium)菌株在工业上生产丁酸应用最广泛，这其中研究较为深入的产丁酸菌株有：丁酸梭菌(C.butyricum)[3-6]、土丁梭菌(C.tyobutyricum)[7-10]和热丁烯梭菌(C.thermobutyricum)[11-14]。丁酸梭菌和土丁梭菌生长环境的温度一般在25～37 ℃，热丁烯梭菌的最适生长温度是55 ℃；培养基的pH范围是4.0～9.8，培养基pH差异通常会导致乙酸盐和丁酸盐这两种产物的比例变化。土丁梭菌生长时可被利用的碳源有葡萄糖、木糖和果糖[15-16]，热丁烯梭菌生长时可被利用的碳源有单糖(但不能利用阿拉伯糖、半乳糖)、二聚糖、低聚糖和多聚糖[13]。目前产丁酸的菌株主要是丁酸梭菌，又叫作酪酸梭菌，主要有直立和弯曲两种形态，厌氧菌可单个或成组出现，菌体有鞭毛，能通过鞭毛运动，孢子繁殖，孢子圆状，菌体膨大后会呈现不同形态，主要为梭形[17]，乳白色菌落，直径在1～3 mm间，表面有光泽。丁酸梭菌生长环境需要严格厌氧，温度在30～37 ℃和pH在5.0～7.5最为适宜[18]。丁酸梭菌在进行发酵时绝大部分的可溶性碳水化合物和醇都能被利用，但是不能利用卫矛醇、山梨醇以及鼠李糖。丁酸梭菌的代谢产物主要是丁酸、乙酸、甲酸和丙酮，有些也产生乳酸、琥珀酸和丁醇[19]。在自然界中可以很容易获取该菌株，比如动物的排泄物。

3 微生物发酵产丁酸的细胞代谢途径及其调控

利用分子生物学手段对微生物菌株进行遗传改造，目的是提高菌株的生产性状，这种方法目前已经应用于工业微生物中，但关于丁酸产生菌改造的研究报道很少。高效的遗传改造依赖于相关代谢途径在分子水平上调控机制的阐明，这为选育高生产效率的菌株奠定了基础。

通过微生物发酵生产丁酸的细胞代谢过程是：首先，产丁酸菌通过糖酵解途径将碳水化合物变为丙酮酸(PA)，丙酮酸与辅酶A形成乙酰辅酶A，再通过饱和脂肪酸合成途径将乙酰辅酶A变为丁酰辅酶A。当丁酸激酶存在时部分丁酰辅酶A会直接转变为丁酸，还有部分丁酰辅酶A与乙酰辅酶A转移酶结合形成丁酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶，这种转移酶在一定的条件下可以产生丁酸，以及乙酰辅酶A。有部分乙酰辅酶A生成乙酸[20]。一般认为，丁酸激酶是丁酸菌的丁酸途径中对丁酸生成起主要作用的酶，然而近年随着大量的实验研究数据显示，丁酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶很有可能是主要生产丁酸的酶[21-25]。

产丁酸菌株在合成丁酸和乙酸时生长条件基本相同，而且当这类菌株生长缓慢时，还会产生乳酸。同时，当发酵液pH和未离解酸的量发生变化，以及菌株生长期改变时，这类菌还能产生丁醇和丙酮，所以丁酸型发酵过程中通常不会仅获得丁酸一种产物。因此，如何获得单一的丁酸产物是对产丁酸菌株进行遗传改造的一个重要方向。

4 发酵法生产丁酸的工艺运行方式

微生物发酵生产丁酸的主要问题是产物抑制，这导致微生物发酵法生产丁酸收率低且经济效益差，因此选择合适的生产工艺对发酵法产丁酸的生产效率有很大的影响。

4.1 丁酸的发酵工艺途径

目前工业上采用的连续发酵培养是一种开放的发酵培养方式，这种培养方式可以使微生物在一个相对稳定的状态下进行连续生长，从而提高生产效率，因此与分批发酵和补料分批发酵相比，连续发酵培养中丁酸产率较高，更适合丁酸发酵。连续发酵培养可以根据需要进行人为控制，使微生物在生长曲线中的某个阶段发生代谢速率的改变，从而提高丁酸产量[26]。连续发酵培养技术可以延长有机体指数相，维持营养和细胞数(生物量)波动较小的生长环境[27]。连续发酵培养产生的丁酸浓度往往要高于分批发酵培养，所以通过使用连续发酵培养可以获得更高的生产力。但是，当出现过量碳源、下游处理比较复杂以及最终产物抑制等操作问题时，建议采用在线分离或在线分离与原位产物分离相结合的补料分批发酵工艺。

4.2 采用固定化细胞反应器生产丁酸

固定化细胞是在不溶于水的特殊载体上将细胞固定，使细胞在一定的空间下进行生命活动。固定化细胞的生物反应器有如下优点：首先，在固定化细胞系统中可以获得较高的细胞密度；其次，生物反应器的结构比较简单，当发酵完成后，细胞很容易从中分离，使下游工艺简单化；再次，成本较低。此外，固定化细胞生物反应器可以提高反应器的生产效率(提高效率包括改进反应速率和简化产品分离)[28-29]。细胞固定化可以有效地应用于厌氧过程，这种方式可使丁酸生产率高于普通连续过程。在使用固定化细胞的发酵过程中，通过脉冲添加不同的维生素，可以实现丁酸生产速率的提高。

流化床生物反应器、填料床生物反应器和横流膜系统是目前应用最广泛的固定化细胞生物反应器。这类反应器有很多优势：比表面积大、制造成本低、使用强度高和渗透性好等特点[30]。纤维床生物反应器就是一种典型的填料床生物反应器，固定化细胞处于纤维基质填料上，此反应器已成功用于丁酸的生产，与其他生物反应器的结构相比，此反应器的生产率、最终产品收率和浓度都显著提高，可连续且无重复地进行接种，稳定性好，而且下游产品的加工也简单化[31]。

4.3 单独提取及萃取

萃取时有机相的选择很重要，需要选择一种有效的具有生物相容性的萃取剂。向有机相中加入反应物或载体，也应该是生物相容的，从而增大分配系数。这种有机相如是Alamine 336(三辛胺)或Hostarex 327(三辛基氧化膦)与油醇的混合物，则采用液体膜的效果比简单的提取更好，同时液体膜(有机相)可以再生，产物可以浓缩。第一阶段是发酵液，第二阶段是有机相，第三阶段是水溶液剥离液，这些组合工艺已成功应用于丁酸的萃取。

目前有一种特别的分离方法是络合萃取，在分离过程中溶液的分离相会与络合剂的萃取溶剂反应，所生成的络合物随后再被转移到萃取溶剂相中分离出来；再通过温度或者pH的变化，反应逆向进行，实现再循环。因为低的pH会使丁酸分配系数增大，所以一般发酵液pH为2～3。稀释剂也会影响丁酸的分配系数，主要用的稀释剂是正辛醇或油醇，二者相比，用正辛醇可以缩短平衡时间[32]。

5 发酵法生产丁酸的影响因素

影响微生物发酵法生产丁酸的因素主要有pH、碳源、氮源、底物和终产物、预处理方法以及氧化还原电位。

5.1 pH对发酵法产丁酸的影响

由于发酵法生产丁酸都是利用微生物，而微生物生长有最适pH，同时发酵的产物也会影响发酵液的pH，因此发酵时必须考虑pH的影响。因为丁酸型发酵液的pH会逐渐下降，导致发酵类型发生转化，所以需要人为补加一些能提高pH的料液[19]。同时研究发现在丁酸型厌氧发酵过程中，初始pH为4.0时，随着pH升高酸产量明显提高；当发酵初始pH为5.0时，丁酸产量达到最高，随后进一步提高pH，丁酸产量反而会呈现下降的趋势，但始终高于初始4.0时丁酸的产量。pH为初始4.0时丁酸的产量最低，可能是由于pH为4.0时酸分子所解离出的氢离子可以自由进出细胞膜，一旦过多的氢离子进入细胞后引起细胞质酸化，就会使得介导微生物细胞跨膜转运质子梯度降低，即通常所说的酸碱度下降，最终使依赖于pH梯度的微生物细胞放热反应和转运系统解耦，从而抑制甚至毒害微生物的生长[33-34]。因此，pH对产酸相的最终产物有影响，这是产酸相最终产物的限制性因素之一。

5.2 碳源对发酵法产丁酸的影响

在微生物生长过程中碳源一直是重要的影响因素，生物发酵产丁酸的量和碳源有着密切的关系，一般葡萄糖的效果最好，其次是蔗糖和果糖[23]，但考虑到成本可以联用蔗糖和丁二酸钠作为复合碳源代替传统的单一碳源培养基[35]，这样既能节约成本，又大大的提高了产丁酸的量。

5.3 氮源对发酵法产丁酸的影响

氮源分为无机氮源和有机氮源，二者对不同的微生物菌种的作用不同。通常无机氮源常用硫酸铵作为氮源；相比于使用单一氮源，有机氮源的产丁酸效果比无机氮源的效果更为显著，其中以酵母膏的效果最好[36]。

5.4 底物和终产物对丁酸产量的影响

许多代谢途径都会受到它们自身终产物的抑制。在利用梭状芽孢杆菌发酵产丁酸的过程中，丁酸、乳酸、乙酸、丁醇、乙醇和丙酮都会影响丁酸的产量[35-36]。例如丁醇会改变膜的流动性、膜功能和细胞内ATP水平致使丁酸的产量降低，因此丁酸发酵也受到底物的抑制。未分解的丁酸通过细菌细胞膜进入胞内并最终被分解，它影响跨膜pH梯度并减少了微生物生长所需的能量[36]。在生产过程中为了使丁酸浓度保持在抑制水平以下，曾经用高稀释率来降低丁酸浓度，但是，这不利于下游产物的纯化，所以及时移出产物尽可能的降低丁酸浓度是非常重要的。

5.5 益生素对发酵法产丁酸的影响

益生素是一种含有多种对微生物有益物质的复合型生物制剂，因为它不会对微生物产生毒杀效应，且长期使用不会引起微生物产生抗性，因此益生素成为一种理想且绿色的可以替代传统抗生素的添加剂[37]。

5.6 预处理方法对发酵法产丁酸的影响

在微生物发酵时，为了提高底物的利用率，常对底物进行预处理。目前常用的低成本预处理方法主要有加热预处理和化学预处理，化学预处理又包括酸法预处理和碱法预处理。

5.6.1加热预处理对发酵法产丁酸的影响 加热预处理是常用于厌氧发酵的一种物理预处理手段。生物细胞一旦被热处理后，细胞的状态就会发生一定的改变，例如结合水和蛋白质等会透过膜释放到胞外并水解。细胞在受到不同的预处理温度加热后,受损的细胞位置也不一样：当处理温度在45～65 ℃时，细胞膜会遭到破坏，同时核糖体RNA也会降解；50～70 ℃时的热预处理将使DNA变性；65～90 ℃时细胞壁瓦解导致细胞死亡；70～95 ℃高温处理时蛋白质分解成小分子肽段且易溶于水,成为很好的缓冲剂，让被处理系统有较好的适应pH变化的能力[38]。伴随着不同的热处理温度，细胞在厌氧发酵中所产丁酸的量也会明显不同。进一步研究热处理时间对细胞厌氧发酵产酸的影响，在80 ℃高温下分别进行了15、30、45、60 min的丁酸厌氧发酵：当放置时间为15 min时发酵产酸量很低,随着放置时间的逐渐延长,细胞发酵产酸量明显上升，当放置时间进一步延长至30或45 min时发酵液中丁酸浓度急剧上升，当放置时间上升至45 min后,酸的产量开始呈现出下降的趋势，当放置时间为15和60 min时发现产丁酸的量非常低[33]。热处理时间太短会使得胞内有机物不能被完全破坏溶解且还会影响细胞的破壁从而导致破壁缓慢甚至不彻底,预处理时间过长则会使有机物质状态发生改变或变质，因此实验过程热预处理时间可选择30 min。

5.6.2酸法预处理对发酵法产丁酸的影响 酸式预处理是一种化学预处理方法。在厌氧发酵反应前加入强酸浸泡后的培养基底物，使细胞通透性增加，这样胞内生物大分子降解为小分子物质后可释放到胞外供产丁酸微生物利用。丁酸的厌氧发酵生产pH为4和5时,发酵液的丁酸浓度明显提高,但pH为2和3时,发酵液中丁酸的浓度明显低于pH为4和5时，原因是细胞处于强酸性条件时细胞中的有机物被大量破坏[33]。因此用酸对培养基进行预处理可以使细胞的厌氧发酵能力增强,而且最优条件为pH 4～5。

5.6.3碱法预处理对发酵法产丁酸的影响 碱法预处理也属于化学预处理方法。用碱性溶液调节细胞到特定的pH,可使细胞壁上蛋白质的电荷性质发生改变，从而改变细胞壁的通透性，释放出生物小分子物质[39]，提高产丁酸菌利用底物的效率，进而促进厌氧发酵。

5.7 氧化还原电位对产丁酸的影响

自然界中不同种类的微生物使用的氧化还原电位(ORP)也不相同。大部分需氧微生物的ORP在300～400 mV，而ORP在100 mV以上需氧微生物就能生存；既好氧又厌氧的微生物在ORP是100 mV以上时是需氧的，ORP 在100 mV以下时是厌氧的；ORP为-250～-200 mV是保证全厌氧微生物生存的最低限度，全厌氧的产甲烷细菌需要ORP达到-600～-300 mV。经实验验证，丁酸型厌氧发酵过程需要的ORP值是-420～-350 mV[19]。

6 产丁酸菌株及其代谢产物的生理功能

丁酸梭菌常被用作医药、食品添加剂以及饲料添加剂等，丁酸梭菌代谢产物对人体有很多有益的作用。

6.1 维持肠道微生态平衡

肠道系统在长期进化中已形成一种独特的微生物平衡，而在一定程度上机体的健康程度与肠道菌群的平衡息息相关，因此维持或调节肠道菌群平衡具有重要意义。作为肠道微生物的丁酸梭菌，就为肠道微生态平衡做出很多贡献，它在肠道中可以通过产生超氧化物歧化酶和NADH/NADPH氧化酶抑制无益菌的生长[40]，保障或修复有益菌群适宜生长的环境，从而达到促进肠道中微生物种类和数量的快速平衡。丁酸梭菌代谢的产物如短链脂肪酸、抗菌物质、各种酶、维生素和气体都发挥着它们特有的功效来保护着肠道。例如，由丁酸梭菌产生的纤维素酶等酶类可以降解纤维素等难以利用的有机物，继而产生有益细菌可利用的低聚糖，使得有益菌在肠道中更好的生长。对于肠上皮细胞来说丁酸还是一种重要的能源物质，能促进肠道系统中结肠段细胞的再生和修复，对于改变肠道黏膜结构和提高肠道抗氧化能力的作用也十分显著。因此，由于丁酸梭菌在调节肠道健康方面有着非常显著的效果使得其产生的各种短链脂肪酸的研究也成为热点。

6.2 增强机体免疫功能

研究发现丁酸梭菌可使机体小肠粘膜IgA的量明显升高，抑制微生物的附着[41-43]。因此，丁酸梭菌可增强机体的体液免疫能力。

6.3 抗癌方面

目前，防治肿瘤是医学研究的热点，在这种趋势下出现了一种新型的治疗方法，即利用对机体有益的微生物群落联用防治肿瘤，而丁酸梭菌防癌的原理就是基于此。丁酸梭菌能产生一种特殊酶类，这种酶可分解为激肽，激肽分解后癌组织中大多数毛细血管的通透性和循环能力减弱，癌细胞就会由于缺乏营养补给而死亡，也就是丁酸梭菌可以和癌细胞产生拮抗效应达到抑癌作用[44-47]；而且丁酸梭菌的分泌物具有一定的抗癌作用，可以消除某些致癌物，如丁酸可以消除亚硝铵的致癌活性而达到抗癌效果。同时，由于丁酸梭菌在肿瘤组织中具有一定的定植性和选择性[48]，所以可以通过遗传工程的改造使其分泌治疗性蛋白质，如肿瘤坏死因子等。

7 展望

由于石油能源日趋紧张和农业废弃物造成的环境污染等问题日益突出，农业种植废弃物是生产液体燃料的理想原料，可生产各种有机化学品，包括乙醇、乳酸、丁醇和丁酸等，有机化学品的可持续生产可以改善许多与石油消费相关的问题。由于丁酸能够广泛应用于医药和食品等行业，因此，利用生物技术方法生产丁酸具有很大的市场潜力。

利用生物质原料生产有机化学品的主要障碍是成本问题，其中将纤维素水解成单糖和二聚糖的费用较高，因此，对丁酸产生菌酶学和生理学的研究是现阶段的研究热点，通过诱变和基因重组技术提高丁酸产生菌的酶活力和丁酸产量是研究者们的努力方向。同时，由于发酵培养基的成本对发酵产丁酸的成本影响很大，这还涉及到再生能源如农业废弃物作为发酵底物是否可以有效利用以及生产工艺的优化等问题。因此，微生物发酵生产丁酸还有很长的路要走。