新型冠状病毒疫苗研发的现状与展望

田靖

南部战区 疾病预防控制中心，云南 昆明 650031

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019，COVID-19）是人类进入21世纪以来面临的影响最大的公共卫生性事件。SARSCoV-2感染波及全球,截至2020年5月19日[1]，全球累计报道确诊病例4 696 849人，已致216个国家和地区315 131人丧生，对人类的生命造成严重威胁。

1 SARS-CoV-2感染的致病机制

SARS-CoV-2属于冠状病毒β属Sabecovirus亚属[2]，由日冕状包膜和单链RNA基因组组成。SARS-CoV-2基因组包含29 891个核苷酸，编码9860个氨基酸残基，G+C含量为38%，与人SARSCoV的相似性为82%。通过对结构基因进行进化树分析，发现SARS-CoV-2与SARS-CoV同属β属冠状病毒的B系（lineage B），与其他SARS类病毒亲缘关系较近。

SARS-CoV-2基因组从5'端到3'端依次编码复制酶和结构蛋白。复制酶通过蛋白水解作用水解为16种非结构蛋白（nonstructural proteins，NSPs），参与病毒基因组的复制和亚基因组mRNA的合成。

结构蛋白具有种属特异性，在不同的冠状病毒中表达组成不同[3]。一般来说，冠状病毒的结构蛋白主要由刺突（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白和小包膜（envelope，E）蛋白组成。S蛋白介导细胞与膜的融合，与病毒入侵的毒力有关，是诱导机体产生细胞免疫和体液免疫的主要抗原成分；M蛋白是一种糖蛋白，参与包膜的形成；N蛋白是一种磷酸化蛋白，促进病毒的出芽生殖；E蛋白与M蛋白共同构成病毒的骨架，与病毒颗粒的组装相关。

SARS-CoV-2的结构蛋白除了上述4种外，还识别到几个可能具有功能的假想蛋白，包括ORF3a（b）、ORF6、ORF7a/b、ORF8和 ORF9b，但是缺乏A系（lineage A）β属冠状病毒中普遍存在的血清凝集素酯酶。

不同冠状病毒可以通过与细胞表面的不同受体结合而感染细胞[4]，例如HCoV-22944主要作用于氨肽酶 N（aminopeptidase N，ANPEP）受体[5]；MERS-CoV作用于二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）受体[6-7]；HCoV-NL63 和 SARS-CoV通过血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体进入细胞[8]；ACE2和跨膜丝氨酸蛋白酶 2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）受体对于SARS-CoV-2感染人体可能有很重要的作用[9]。病毒结合的受体类型不同，导致了病毒侵犯的细胞类型差异。在肺组织中，SARS-CoV感染Ⅰ类肺泡壁细胞和巨噬细胞[10]，MERS-CoV主要感染Ⅱ类肺泡壁细胞和非纤毛支气管细胞[11]，而SARS-CoV-2则可能首先通过感染鼻上皮细胞进一步感染人体其他细胞[12]。

冠状病毒对人体的危害，除了病毒病理学损伤外，还可以引起肺部非特异性炎症以及炎症侵润反应，产生一系列因导致免疫系统失去控制的免疫病理反应，进而引起肺组织损伤、功能损害、肺容积降低。SARS-CoV的N蛋白对宿主干扰素反应具有拮抗作用，可以帮助病毒免疫逃逸[13]，CD4+T细胞缺乏会降低肺部招募的淋巴细胞数量，减少中和抗体产生以及细胞因子的生成，导致免疫介导的间隙性肺炎，延缓SARS-CoV从肺部的清除，加速疾病进展[14]。

COVID-19患者T淋巴细胞在感染过程中受到抑制，这一点与SARS研究结果相似[15]，IL-6因子在重症患者中大量增殖，与“细胞因子风暴”相关，免疫抑制现象在重症患者中更为明显[16]。

SARS-CoV-2感染人体并在体内复制时，病毒可以降低人体抗病毒的先天免疫力，与之前其他冠状病毒患者感染机制不同。SARS-CoV-2可以显著抑制Ⅰ型和Ⅲ型干扰素水平，而细胞因子反应则十分活跃，只有当病毒复制数较高时，干扰素反应才启动，有助于COVID-19病情进展[17]。鉴于COVID-19致病机制尚未明确，研究者也试图通过检测乳酸脱氢酶、淋巴细胞和超敏C反应蛋白等标志物的水平来预测新冠患者的死亡风险，以降低死亡率[18]。

2 新冠病毒疫苗研制策略

疫苗对人体的保护作用主要通过诱导体液免疫产生中和性抗体以及刺激T细胞的细胞免疫来完成。体液免疫通常是针对病毒表面蛋白产生中和性抗体，例如SARS-CoV诱导的体液免疫一般针对S蛋白，也有针对N蛋白的，但是抗体在恢复期病人中存在时间较短。在所有的SARSCoV蛋白中，外周血T细胞对结构蛋白产生的免疫性比非结构蛋白来说是较强的，而且T细胞对于S和N蛋白的持续时间最长[19]，可长达感染后第11年[20]。因此，作为一种有效的疫苗，需要同时可以提升抗体反应以及病毒特异性记忆CD4+和CD8+T细胞反应。

2.1 完全灭活病毒疫苗

完全灭活病毒疫苗是指采用化学方法（如甲醛溶液、β丙内酯或焦碳酸二乙酯）或放射线照射方法使病毒基因组不具有感染性而同时保留病毒颗粒结构，处理之后的病毒具有抗原性而消除了潜在的感染力。对SARS-CoV的疫苗研究发现，灭活病毒确实可以促进中和抗体的产生[21-22]。

灭活疫苗研发时间较短，容易制备，使用安全，是一种较为传统的疫苗。我国在灭活病毒疫苗方面在国际上处于先进水平[23]，已经研制上市的有2015年获批的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Vero细胞）、针对手足口病的肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）和甲肝疫苗等。

灭活疫苗需要对病毒进行扩增培养，因此选择适合病毒扩增的培养基（鸡胚、细胞等）以及符合相应生物安全标准的病毒培养环境十分重要。

2.2 减毒疫苗

减毒疫苗是通过化学或基因突变等方法使活病毒毒性相对减弱，病毒可以继续在体内复制感染，但是症状减轻甚至不出现症状。减毒疫苗可以模拟自然发生的隐性感染，引起先天性和获得性免疫反应，而且保护能力可能持续终生。

常常通过自然筛选和人工诱变方法获得毒力较弱的毒株来制备减毒疫苗。利用反向基因工程方法则可以大幅度简化毒力衰减相关基因座的发现过程，而且在细胞培养和小鼠中发现不容易出现病毒毒力恢复的“返祖”现象，这一思路可用于冠状病毒疫苗研制。采用反向基因工程方法制备冠状病毒疫苗有以下策略可以参考。

2.2.1 通过对特定基因的修饰或删除获得减毒株 SARS-CoV通常编码许多免疫调节蛋白，理论上对与IFN拮抗活性相关的蛋白以及病毒抗性机制相关蛋白基因（如 nsp1、nsp3、nsp16、M、3b等）进行删除或修饰，获得减毒病毒株。研究证明，将 SARS-CoV的nsp1[24]和nsp16位点[25]突变后得到了SARS-CoV减毒株。

2.2.2 对病毒复制的保真度进行修改 冠状病毒是一种RNA病毒，遗传物质RNA稳定性较差，具有很强的变异性。可能因为如此，所有的冠状病毒都在NSP14编码区的开放读框1（ORF1）编码一种核酸内切酶ExoN，ExoN对RNA依赖的RNA聚合酶活性具有矫正作用。当SARS-CoV的ExoN蛋白失活后，产生的病毒株虽然能存活，但复制能力会衰减，而且病毒传代过程中这一突变可以被积累[26]。对SARS-CoV MA15株的ExoN进行缺失突变后得到SARS-CoV MA-ΔExoN病毒株，该病毒株在低龄小鼠（10周龄左右）、老龄小鼠（14月龄左右）以及免疫缺陷小鼠中的繁殖能力和致病性均减低，但是可以刺激小鼠产生中和抗体到达一个低剂量免疫接种水平[27]，在短期和长期的传代过程中，病毒的复制和抑制返祖现象都非常稳定。

2.2.3 针对病毒保守区域进行改造 针对基因座的保守区域进行改造的策略很可能产生能针对序列未知的新型冠状病毒的有效疫苗，可以由此设计出针对某一类型冠状病毒的广谱疫苗，当人类面临新发传染病时化被动为主动。MERS-CoV疫苗的发展过程中就有效利用了这一反向基因工程系统的方法[28]。

2.3 病毒载体疫苗

借助某种改造后的病毒作为载体，将目标病毒基因递送入人体细胞后，人体将不能合成新的病毒颗粒，但可以合成目标病毒的抗原组分，引发免疫应答反应，从而产生抗体。病毒载体疫苗在宿主中作为一种遗传物质而存在，直接感染抗原提呈细胞，具有先天佐剂的效果，能有效诱导先天免疫反应以及B、T细胞介导的免疫反应。

常用的病毒载体有腺病毒载体表达系统，该系统表达了含SARS-CoV的S蛋白和N蛋白的腺病毒粒子。腺病毒载体疫苗的免疫效果通常取决于制备方法、给药途径以及选用的动物模型等。就给药途径而言，肌肉注射免疫可以诱导血浆产生高滴度的中和抗体，鼻腔黏膜给药更能有效阻止侵入病毒的复制，意味着鼻腔途径对于诱导黏膜免疫更为有效[29]。

此外，委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephaitis virus，VEE）的病毒复制颗粒（viralreplicon particles，VRPs）也 被 用 于 表 达SARS-CoV的S蛋白和N蛋白[30]。

其他用于表达S蛋白的病毒载体还有痘病毒（Poxvirus）[15]、副流感病毒（Parainfluenza virus）[31]、狂犬病毒（Rabies virus）[32]及水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus）[33]等，均能诱导产生中和抗体，其中一些重组病毒也显示出保护作用。利用麻疹病毒（Measles virus）载体表达SARS-CoV的S蛋白被发现可以诱导产生中和性抗体和较强的Th1细胞反应，同时兼顾了体液免疫和细胞免疫，是未来抗病毒疫苗设计的很有希望的方向[34]，但是消灭麻疹病毒的全球策略可能会限制这类病毒载体的应用。

2.4 亚单位疫苗

亚单位疫苗是选择病毒中感兴趣的目标抗原组分来制备疫苗。与病毒载体疫苗的区别在于，载体的整个复制和扩增过程不是在被接种者体内进行，而是在实验室内进行，然后收获的抗原组分被制备成疫苗。SARS-CoV的亚单位疫苗一般都包含S蛋白或N蛋白片段。亚单位S蛋白疫苗相比减毒SARS-CoV疫苗、痘病毒S蛋白疫苗或DNA-S蛋白疫苗产生更多的中和抗体[35]，但是中和抗体的保护效果未知[36-37]。

封闭受体ACE2与受体结合结构域（receptor binding domain，RBD）位点相结合的受体结合基序（receptor-bindingmotif，RBM）被 认 为 是 与SARS-CoV发生中和作用的主要机制。然而中和抗体不单识别RBM，抗体与RBM之外的其他部位的结合也可能引起构型改变来引发RBM结合机制[38]。SARS-CoV蛋白RBD晶体结构被测定[39]，可以作为亚单位疫苗的靶标。

SARS-CoV-2基因组中S1亚基的RBD核心区域高度保守,但RBM结构域的相似性只有59%，因此来源于SARS-CoV的多克隆中和抗体对于SARS-CoV-2的效果是有限的[40]。SARS-CoV的特异性单抗CR3022可以与SARS-CoV-2结合，但病毒与CR3022的结合位点与ACE2结合位点不重合，同时一些特异性结合SARS-CoV的抗体却不能与SARS-CoV-2结合，说明SARS-CoV和SARSCoV-2的RBD位点的差异性对于抗体的交叉中和作用十分关键[41]。近期从康复者血清中分离到的4种人源SARS-CoV-2单克隆抗体均可以与SARS-CoV-2的RBD结合，但不与SARS-CoV结合，证明这2个RBD结合表位在免疫学上是相互独立的。RBD结合表位的研究将为疫苗开发及小分子治疗药物研发提供基础[42]。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗是将含有编码抗原组分的DNA载体直接注射或接种到被免疫者体内，通过被免疫者细胞内自身的蛋白表达系统合成抗原蛋白，最终达到细胞膜表面，诱发针对该抗原的CD4+、CD8+T细胞免疫及B细胞体液免疫反应。

和病毒载体、亚单位疫苗一样，S蛋白或多肽片段也是DNA疫苗中用来刺激产生中和抗体的靶标[43]。有趣的是，编码S蛋白的DNA疫苗（即DNA-S疫苗）与完全灭活疫苗联合使用时，细胞免疫反应是Th1细胞直接介导的，而单独使用灭活疫苗是Th2细胞介导的[44]。而编码N蛋白的DNA疫苗（DNA-N疫苗）虽然可以诱导很强的细胞免疫反应，但在遭遇高滴度病毒攻击时并不显示保护作用。并且，DNA-N疫苗可以诱发迟发性的高敏反应，甚至于在产生抗体的过程中也可以出现[37]。

2.6 RNA疫苗

对于大多数现有疫苗来说，最主要的障碍并不是有效性问题，而是如何大规模、更加迅速地开发新疫苗，以应对如癌症等一些非感染疾病，以及突然暴发的各类传染病等。在这样的背景下就诞生了mRNA疫苗。

早在1990年，研究者就发现在小鼠体内注射体外转录的mRNA后可以在体内检测到相关蛋白的表达[45]，但这些研究并没有进一步发展为mRNA治疗，主要是由于mRNA在体内递送过程中稳定性差、较高的先天免疫原性、体内表达无效性等问题的限制。而过去的10多年中，一些关键技术的创新已经使mRNA成为疫苗领域具有前景的方案。与蛋白免疫接种不同，mRNA疫苗能够引起强烈的CD4+或CD8+T细胞应答；与DNA疫苗不同，在动物体内mRNA疫苗可以通过一两次低剂量接种就能产生抗体。

mRNA疫苗的优势体现在mRNA是一种非感染物质，不易与染色体发生整合，具有较强的安全性；通过一定的修饰方法可以使mRNA更稳定，翻译效率更高，达到体内有效表达；mRNA作为一个最小的基因载体，针对载体的免疫性可以避免，因此可以重复使用；生产方法快速、廉价、质量可控，可以短时间达到较高的产能。

然而，人体实验表明，mRNA疫苗在人体内诱导抗原产生的抗体滴度比动物模型体内产生的抗体滴度要低[46]。对于首个在人体开展验证性临床试验mRNA预防性疫苗CV7201，虽然具有一般的安全性和合理的耐受性，但是由于给药方式的不同可能导致一些更加严重的副作用[47]。

由此看来，各种疫苗平台都有其优势和不足。灭活病毒疫苗的制备因为要采用活病毒，需要注意生物安全性方面的问题；亚单位疫苗、完全灭活疫苗或构建载体疫苗在实验室层面上是可以快速获得的，但这种疫苗常常出现中和抗体滴度较低、维持时间较短，具有产生免疫病理反应及嗜酸粒细胞增多症的风险；DNA疫苗中目的基因选择的有效性、载体表达效率和调控、免疫耐受以及DNA整合到宿主基因组风险等安全性问题都需要考虑。未来研制病毒疫苗的主要策略可能集中在生产缺乏主要毒力标记物的活减毒疫苗方面。减毒疫苗保护效果较长，拥有与天然病毒相同的抗原，免疫谱也较为全面。

3 新冠疫苗研发现状和挑战

截至2020年5月15日，全球有118种COVID-19疫苗在紧锣密鼓的开展研究，其中8种展开了临床评价，110种处于临床前研究阶段[48]。从疫苗研发平台来说，病毒载体疫苗、完全灭活疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗研发速度较快，均开展了临床试验，而减毒疫苗和亚单位疫苗等则大多处于临床前研究阶段。正在开展临床评价的8种疫苗中，包含由我国科学家主持研发的3种完全灭活疫苗和1种病毒载体疫苗。

较好的免疫原性、充分的稳定性和安全性，并且能产生长期的免疫效果是成为好疫苗的必要条件。为了满足这些条件，需要对病毒的生物学基础和致病机理进行深入的探讨，弄清楚抗病毒B细胞和T细胞是如何发挥保护作用的，以及病毒主要抗原具有的复杂性和多变性是否会影响疫苗的效果等问题。

3.1 疫苗研发受限于合适的动物模型

临床前实验只是疫苗进展的一小步，如何评价疫苗的安全性和有效性才是研发链条的关键。由于缺乏可以模拟人类感染冠状病毒症状的合适动物模型，阻碍了冠状病毒疫苗的研发。良好的动物模型须能够模拟疾病感染的途径和症状、疾病严重程度，以及在人群中疾病致死率相当，而且病毒作用受体应该与人类感染相同[49]。

小鼠、仓鼠、非灵长类动物、雪貂、兔等动物模型都被报道用于研究冠状病毒在人类中的病理反应[49-50]，但这些动物模型有的因为体积过大不适合在BSL-3动物实验室研究，有的不能完全模拟病毒感染人类的病理学，有的检测指标改变不明显而不能评估相关的免疫学反应。未来可能通过转基因小鼠满足部分研究需要[51]。

雪貂被认为是在抗击这次新冠病毒感染中最有潜力的动物模型，雪貂对于SARS-CoV-2易感，在体内复制病毒，并具有传染性。雪貂ACE2与人类ACE2在基因结构上相似，可以帮助研究COVID-19患者的病毒病理学反应，为疫苗研发助力[52]。此外，研究发现，SARS-CoV-2虽然被认为起源于蝙蝠，在与人类亲密接触的动物中，猪、鸡、鸭等对于该病毒不易感，狗对于SARS-CoV-2的易感性较低，而家猫对于该病毒易感。引发猫传染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，FIP）的猫冠状病毒已被研究多年，被认为能产生类似于人类COVID-19患者的细胞因子风暴综合征针对SARS-CoV-2的中和性抗体[53]。

3.2 重视疫苗研发的安全性

SARS-CoV疫苗在体内可以诱导的超敏反应，是由于其特有的某种病毒成分造成的。冠状病毒N蛋白的自身特性可能是完全灭活疫苗产生嗜酸粒细胞增多症的原因[54]，而表达S蛋白重组DNA疫苗、病毒载体疫苗和完全灭活疫苗中均发现可在小鼠体内诱导相关的免疫病理反应[55]。

使用亚单位疫苗，当S蛋白抗体在体内滴度较低时容易产生抗体依赖性感染增强（antibodydependent enhancement of infectivity，ADEI），导致细胞病变反应以及TNF-α、IL-4和IL-6[56]等因子的升高。动物或人体在接受免疫接种后如果再次接触病毒，可能产生Ⅱ类免疫病理反应引起的肺损伤等免疫相关疾病，可以通过给予Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）拮抗佐剂避免[57]。

免疫病理反应可能是由于疫苗引起的Th1免疫应答不足所致，需要用合适的佐剂最大限度增强Th1免疫应答，诱导持续的IFN-γ反应。例如，当接种疫苗足以抵抗致死剂量病毒感染的条件下，用δ菊粉免疫佐剂增加血清中和抗体的滴度，3 d后降低肺中的病毒滴度[58]，肺部免疫病理反应不出现，而不使用该佐剂小鼠6 d后将引起肺部嗜酸性细胞免疫病理反应。可能δ菊粉通过提高T细胞IFN-γ-recall反应的机制消除了免疫病理反应[51]。

3.3 疫苗开发需要基础研究做支撑

研究发现，记忆CD8+T细胞在SARS-CoV感染后可以持续长达6年的时间，对于免疫优势表位具有特异性，可以保护老年小鼠遭遇致死剂量的SARS-CoV感染[19]。当SARS-CoV感染时，记忆CD8+T细胞可以通过产生一些有效的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等，减少病毒在肺中的载量。但是，一些炎症因子如Ⅰ型干扰素的调控失常、单核细胞-巨噬细胞反应会导致致死性肺炎，这一机制需要在疫苗设计过程中加以考虑，以降低疫苗的免疫病理学作用[59]。因此，进一步全面了解病毒的感染机制，才能有助于研发能够产生有效保护作用，且对人体没有明显副作用的安全疫苗。

疫苗研发是一个投入时间长，同时充满不确定风险的过程。为了缩短疫苗开发时间，需要对传统疫苗“按部就班”的开发策略进行调整，在疫苗安全性和有效性尚未确定时，同时进行诸多环节的准备。例如，Ⅰ期临床试验可以与动物实验同时进行；在进行Ⅱ期临床试验时，可以准备将疫苗生产规模扩大到工业化生产水平等。这种新的策略会使疫苗研发时间缩短，但毫无疑问也大大增加了研发成本和失败的代价[60]。

如果我们很“走运”，在短时间内研制出相对安全有效的疫苗，仍然还有很多问题需要解决：怎样合理评估需要接种的人群？如何制定接种策略、评价接种效果？这一系列问题，值得我们深思并为之努力。