生发中心B淋巴细胞活化机制研究进展

张艺凡，沈倍奋，宋伦

军事科学院 军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

机体的获得性免疫反应主要由T淋巴细胞活化介导的细胞免疫反应以及B淋巴细胞活化诱导的体液免疫反应组成。其中，B淋巴细胞主要通过产生特异性抗体发挥免疫调节功能。特异性抗体的形成主要来自生发中心（germinal center，GC）。生发中心B淋巴细胞的活化异常可引发多种病理反应，甚至诱发恶性淋巴瘤等疾病发生。近年来，人们越来越重视免疫相关疾病的研究，并相继提出多种免疫治疗方法。本文将着重阐述B淋巴细胞在生发中心的活化机制以及活化反应异常所导致的一些相关免疫疾病。

1 生发中心的形成机制

在哺乳动物中，B淋巴细胞是机体执行免疫应答功能的重要细胞成分。胚胎早期的B淋巴细胞在胚肝（胎肝）的造血细胞岛中产生和分化成熟，之后逐渐被骨髓所代替，直到出生B淋巴细胞的产生和分化都在骨髓中进行。在骨髓微环境中，B细胞经历阳性选择和阴性选择，这会造成约75%的B细胞发生凋亡，只有少量经历免疫球蛋白基因重排的B细胞能够成为功能性B淋巴细胞[1]。随后，成熟的B淋巴细胞进入外周淋巴器官，集中分布在淋巴结皮质浅层的淋巴小结、脾脏的红髓和白髓的淋巴小结内。外界病原体突破人体第一道防线后可引发B淋巴细胞发生免疫应答。活化的B细胞可以移入卵泡外区域，然后增殖和终末分化为分泌抗体的短期浆细胞，或者在富含T细胞的区域与T细胞共同迁入B细胞淋巴滤泡，然后增殖并形成生发中心[2]。生发中心内的大多数B细胞发生凋亡，其余B细胞在抗原刺激和T细胞辅助下继续分化发育，并经历体细胞高频突变（somatic hypermutation，SHM）、亲和力成熟和Ig类别转换重组（class switch recombination，CSR）等过程，最终形成长期浆细胞并分泌功能性抗体执行体液免疫功能[3]。

2 生发中心B淋巴细胞的活化机制

2.1 T细胞对生发中心B细胞活化的辅助调控作用

成熟B细胞定居的外周淋巴组织周围存在大量T细胞，可在一定条件下由趋化因子驱动参与B细胞的活化过程。在淋巴结中，T细胞和大多数树突状细胞（dendritic cell，DC）位于皮质旁区淋巴结的中心，称为T细胞区，B细胞存在于淋巴结皮质内的滤泡中[4]。在脾脏中，B细胞存在于白髓内的滤泡中，在脾脏中心小动脉周围有丰富的T细胞[5]。

生发中心分为暗区（dark zone，DZ）和亮区（light zone，LZ）2个区域。在暗区中，除B细胞密集并可迅速分裂增殖外，还包括能够产生趋化因子CXCL12的基质细胞以及能够清除凋亡B细胞的巨噬细胞[6-7]。在亮区中，B细胞的密度较小，同时存在T滤泡辅助细胞（T follicular helper，Tfh）和滤泡树突状细胞（follicular DC，FDC）[8]。为了产生有效的抗体，FDC可将抗原浓缩、滞留在细胞表面并维持数周到数年，B细胞受体（B-cell receptor，BCR）识别和结合FDC滞留的抗原后将其呈递给主要组织相容性Ⅱ类分子复合物（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）[9-11]，随后Tfh与MHCⅡ分子上的T细胞受体（T-cell receptor，TCR）结合进而与 B 细胞相互作用[12-13]，以此区分分别表达高/低亲和力抗体的B细胞，由此筛选出的表达高亲和力抗体的B细胞接收Tfh信号后迁移到暗区[14-15]。在暗区，B细胞迅速增殖并发生SHM、CSR等。研究证明，CD4+T细胞亚群中除了参与抗原提取的Tfh外，其他亚群也参与了B细胞在生发中心的活化过程。B淋巴细胞接受抗原刺激最先产生的抗体是IgM，生发中心的T辅助细胞（Th）所分泌的细胞因子可直接调节免疫球蛋白转换的类别。如Th2细胞分泌的IL-4诱导免疫球蛋白类别转换为IgG1和IgE，Th2细胞分泌的TGF-β可诱导免疫球蛋白类别转换为IgG2b和IgA，Th1细胞分泌的IFN-γ可诱导免疫球蛋白类别转换为IgG2a和IgG3。总之，CD4+T细胞是参与生发中心B细胞活化反应的必要因素。

2.2 生发中心中抗体多样性形成的遗传基础

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）多样性的产生取决于Ig基因座中的4种遗传改变机制，即VDJ重组、SHM、基因转换（gene conversion，GC）和CSR。在骨髓中，B淋巴细胞祖细胞完成VDJ重组，通过重组激活基因（recombination activating genes，RAG）1、2调控特异位点进行重组，并与B淋巴细胞分化同时进行[16-17]。VDJ重组产生大量的免疫球蛋白，包括可识别低水平抗原的免疫球蛋白。成功完成VDJ重组的所有B淋巴细胞均在表面表达IgM并迁移至次要淋巴器官，遇到抗原而被激活[18]。抗原刺激会在生发中心活化B细胞并诱导后续3种类型的遗传改变[19-20]。目前研究发现，激活诱导的胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）对 CSR 和 SHM 必不可少[21]。生发中心B细胞表达高水平的AID，AID将SHM期间Ig可变区基因外显子中的胞嘧啶脱氨为尿苷（U），或CSR期间S区中的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，造成鸟嘌呤（U/G）错配，随后可以通过常规的切除修复（base excise repair，BER）或错配修复（mismatch repair，MMR）高保真地修复U/G病变（即C/G）[22]。在此过程中，B细胞依赖2个独特的机制保护其基因组的完整性，即AID的选择性定位和基因特异、高保真的尿嘧啶修复。研究发现，AID能够脱去大部分表达基因上的氨基。正常人B细胞SHM靶基因包括免疫球蛋白基因（BCL6、FAS、CD79A、CD79B）和肿瘤基因（Myc、Pim1、Pax5、Ocab、H2afx、Rhoh 和 Ebf1）[23]。AID在整个基因组范围内广泛地起作用，在高保真的修复和易错的修复之间达到某种平衡，从而完成最终的突变。通过以上机制，B淋巴细胞产生多种多样的Ig分子，使机体在复杂多变的环境中以相应的特异性抗体抵抗外界的抗原物质。

2.3 生发中心反应产生和维持的分子机制

淋巴细胞发育需要细胞因子和转录因子网络的协同作用，通过转录因子正向和负向调节进而控制基因表达。B细胞在生发中心亮区向浆细胞的终末分化过程也是一系列基因协调表达的结果，其转录调节的网络控制B细胞内的基因表达，决定B细胞亚群类别和发育途径。

在细胞水平，生发中心B细胞不断地在暗区和亮区之间迁移，此过程由趋化因子CXCR4和CXCR5驱动。与B细胞分化密切相关的2种特殊细胞FDC和Tfh也具有运动性。此外，各种转录因子的高度调控也使得生发中心一直处于动态变化之中[24]。经过B细胞在生发中心暗区与亮区中反复增殖及多样化和选择循环，生发中心产生了高亲和力浆细胞和记忆B细胞。在分子水平，c-Myc在生发中心循环过程中发挥重要作用。c-Myc只在一小部分生发中心亮区B细胞中表达，该细胞富含高亲和力的BCR，可通过加强与Tfh之间的相互作用从而导致其重新进入暗区并刺激细胞分裂增殖[25]。此外，趋化因子受体CXCR4是Foxo1靶标之一[26]，Foxo1通过下调CXCR4引起暗区的缺失，继而造成生发中心循环过程受阻。研究证实，即使提供足够的T细胞，Foxo1缺失的生发中心B细胞增殖能力也会变弱。除CXCR4外，Foxo1还参与上调B细胞转录激活因子（B cell activating transcription factor，BATF）。BATF的缺失同样导致了生发中心的破坏[27]。

在成熟的B细胞分化过程中，B细胞淋巴瘤因子 6（B-cell leukemia/lymphoma 6，BCL6）基因的表达受到严格调节，而BCL6蛋白的表达则局限于生发中心的分化阶段。BCL6的表达对于生发中心的形成是必需的，研究发现BCL6可以直接抑制超过1000个靶基因表达[28]，其中包括DNA损伤、细胞周期调控和其他进程的靶基因（如ATR、TP53、CDKNIA），进而促进 Ig亲和力成熟。另外，BCL-6还可直接或间接地抑制B淋巴细胞诱导成熟蛋白1（B lymphocyte induced maturation protein 1，BLIMP1）的表达，从而阻断生发中心B细胞的进一步分化。

2.4 生发中心反应的能量调控机制

生物体内各种物质按照一定规律不断进行新陈代谢，为生命活动提供能量。在种类多样的免疫细胞中，物质和能量代谢在维持自身和机体稳态过程中也不可或缺，免疫细胞需要大量的能量和中间代谢物来满足生物合成的需要，从而在短时间内完成增殖、活化，进而发生免疫应答。同时，能量代谢对于免疫细胞的功能和表型也具有重要影响。代谢重编程是免疫细胞活化的重要特征[29]。例如，巨噬细胞极化与铁代谢和脂质代谢密切相关[30]；同样，DC和T细胞在活化后的葡萄糖和氨基酸代谢也发生了变化[31]。处于静息状态的淋巴细胞对葡萄糖需求很低，大部分ATP通过氧化磷酸化获得，而淋巴细胞在激活后葡萄糖代谢明显增强。这一过程对于免疫细胞生长和增殖以及产生表达蛋白质是必要的[32]。生发中心反应是高度活跃的过程，需要大量ATP提供能量。研究证明，受到抗原刺激后，B淋巴细胞的能量代谢会发生快速变化，以提供支持生长所必需的ATP和合成代谢前体。B淋巴细胞通过迅速增加BCR活化后的葡萄糖摄取和糖酵解来供能。活化的B细胞上调细胞表面葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter type 1，Glut1）的表达并增加细胞的葡萄糖利用率，该反应依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI-3K）/Akt信号通路的诱导活化[33]。此外，缺乏PI-3K调节亚基p85α的B细胞可以通过IL-4介导葡萄糖摄取、Glut1表达和糖酵解。IL-4主要通过Stat6依赖性途径调节葡萄糖能量代谢反应[34]。

总之，B淋巴细胞可通过代谢重编程加快消灭病原体，而能量代谢产物可以影响免疫细胞的分化和功能，彼此形成复杂的相互调节网络。

3 生发中心活化异常与免疫相关疾病

生发中心在维持免疫系统稳态中发挥重要功能。生发中心B淋巴细胞活化异常和浆细胞生成缺陷，都会造成无法产生有效的抗体和建立长期记忆反应，导致机体遭受病原体的反复感染，甚至导致恶性肿瘤（如淋巴瘤）的产生[35]。美国五大常见癌症之一霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）就是由B细胞生发中心反应失调所引发。HL是淋巴瘤的常见类型，发病常侵犯于淋巴结。研究证明HL的特征性RS细胞（Hodgkin Reed-stainberg，HRS）具有B细胞性质，并且原代HRS细胞也经历VDJ重排、SHM、CSR这些仅在抗原激活的B细胞中发生的过程，这表明这种淋巴瘤来自成熟的生发中心。此外，参与生发中心反应的转录因子异常也会调节B细胞淋巴瘤的发生发展。BCL6在建立B细胞的生发中心表型中具有关键作用，而大多数淋巴瘤都依赖BCL6维持生存和增殖，甚至可能逃避免疫的监视。许多与淋巴瘤发生相关的基因点突变具有增强BCL6致癌功能或克服其某些肿瘤抑制作用的共性[36]。研究证明，约30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）存在BCL6基因的表达异常，BCL6基因易位和突变改变了其启动子调节模式从而导致其异常表达[37]。生发中心反应中含有丰富的基因点突变和克隆多样性，因此衍生的淋巴瘤主要来自基因突变，AID可在基因组的许多位置触发突变，大大增加了基因组由于SHM而积累大量突变的可能性。如果这些突变在错配和碱基剪切修复的共同作用下得到修复则不会形成肿瘤，但仍有约25%的基因没有得到上述2种机制的完全保护，因此其突变在生发中心B细胞会不断累积，最终造成淋巴瘤的发生。

4 结语

B淋巴细胞在生发中心的反应十分复杂，T细胞的辅助功能、抗体多样性的产生、转录因子的调控、能量供应等一系列因素异常都会造成B细胞活化出现问题，从而使B细胞不能产生高效抗体抵抗病原体，进而影响机体健康。近年来人们对免疫性疾病的关注度越来越高，免疫治疗俨然成为临床治疗的新趋势。针对淋巴细胞活化机制采取相应的免疫治疗手段是未来该领域的聚焦方向，但目前关于B细胞在生发中心的活化机制仍然存在很多疑问，提示我们从多个方向对生发中心反应机制进行探索研究值得格外关注。