TKS4和TKS5在肿瘤中的研究进展

李青峰，奎翔，易晓佳，王小芳，王燕

昆明医科大学第二附属医院 病理科，云南 昆明 650100

酪氨酸激酶底物（tyrosine kinase substrate，TKS）适配蛋白由N端PHOX同源（PX）结构域及多个酪氨酸激酶Src同源3（SH3）结构域组成，富含脯氨酸区域（PRR）和Src磷酸化位点。SH3结构域、Src磷酸化位点和PRR基序有助于与其他蛋白结合；PX结构域属于磷脂酰肌醇结合模块超家族成员，参与TKS蛋白与磷脂的结合[1]，使得它们相互作用并协调信号转导事件的发生。侵袭性伪足和足小体是其重要的表现形式。侵袭性伪足通常用于描述癌细胞中的结构，而足小体是指与非癌细胞中的基质重塑有关的类似结构，包括树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和破骨细胞[2]。对侵袭性伪足的研究较广泛，主要关注细胞侵袭、转移等方面。侵袭性伪足表现为腹侧质膜的肌动蛋白突起，并含有能够降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶，与人体癌细胞形成及其体内、外侵袭力有关[3-5]。Cejudo-Martin等[6]研究表明，足小体的基本成分的缺失是导致多种人类综合征的主要原因，其中一些症状的特点是颅面部、骨骼和心脏发育严重缺陷，且预后很差。同样，TKS蛋白中的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在 Src转化细胞中对癌细胞的侵袭性伪足和足小体的形成和功能均有调节作用[7]，最主要体现在TKS4和TKS5蛋白。目前有关TKS蛋白亚型TKS4和TKS5的研究甚多，主要涉及侵袭性伪足和足小体在肿瘤中的意义，但分子机制和信号通路研究较少。

1 TKS4和TKS5

TKS4（TKS with four SH3 domains）和 TKS5（TKS with five SH3 domains）的结构整体相似，在功能上有一定的重叠，都有N端PX结构域，前者带有4个SH3域，后者带有5个SH3域，在人体中二者的整体结构相似性为36%。TKS4和TKS5分布广泛，存在于从鱼到人的各种脊椎动物中。

TKS4编码基因位于人5号常染色体上，带有4个SH3域，是一种新型支架蛋白，在细胞粘连形成中发挥重要作用[8-9]。在对Src转化成纤维细胞的研究中，发现TKS4是形成足小体的关键因子，是一种动态的富含肌动蛋白的质膜突起，参与了细胞黏附、迁移和基质降解。同时，TKS4调节膜Ⅰ型基质金属蛋白酶（membrane type 1 matrix metalloproteinases，MT1-MMP）的定位、分泌和稳定，促进了ECM蛋白水解并介导肿瘤侵袭能力的增加[10-11]。TKS4蛋白是一个可调控蛋白，在足小体形成、细胞迁移、间充质干细胞分化和骨小梁形成中发挥重要作用，同时TKS4也是促进肿瘤侵袭力的关键因子之一[12]，对于其机制和功能的研究很有必要。

TKS5编码基因位于10号染色体，带有5个SH3域，是形成侵袭性伪足的关键支架蛋白，Src介导的TKS5酪氨酸557/619位点磷酸化，进行侵袭性伪足相关蛋白招募，最终形成侵袭性伪足，促进癌细胞迁移。TKS5在侵袭性癌细胞中表达，在非侵袭性细胞中不表达，这表明TKS5可能在侵袭性伪足形成启动过程中起核心作用，同时也是人类癌细胞基质侵袭所必需的因子之一[13-14]。

2 TKS4与肿瘤

在肿瘤的研究中，TKS4呈现出负调控机制。研究表明[15]TKS4支架蛋白与癌症进展有一定的关联，目前TKS4在几种癌症类型中的作用已被提及，包括乳腺癌[16]、黑色素瘤、急性髓细胞白血病和前列腺癌[17]。TKS4作为一种关键的内毒素标记蛋白，是用来监测结肠癌和乳腺癌细胞在体内、外侵袭能力的标志物之一[18]。

2.1 TKS4与黑色素瘤

黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，一旦肿瘤发生，转移率极高，对患者的生命造成巨大的威胁。研究显示[11,19]TKS4是黑色素瘤生长的重要调节因子，在人类黑色素瘤中高表达，在侵袭性癌细胞中明显过度表达，在肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用，更多可能与侵袭性高低程度有关，影响患者的预后。

2.2 TKS4与急性髓细胞白血病

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性的白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。Li等[28]利用生物信息学分析得出，急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）相关基因的缺失和异常甲基化与TKS4有关系，表明AML表观遗传学发病机制对AML的精准治疗有重大意义。同样，TKS4被证明在各种体外模型中促进肿瘤细胞的迁移，并且在调节内皮细胞功能方面及在肿瘤诱导血管生成中可能起重要作用[20]，对肿瘤的生长起助推器的效果，加重患者病情。

2.3 TKS4与遗传性疾病

TKS4基因纯合突变会导致名为弗兰克-泰尔哈尔综合征（Frank-ter Haar syndrome，FTHS）的遗传性疾病，患者表现出几种与组织发育异常相关的严重症状，如伴有或不伴有青光眼的大角膜、短头畸形、较大的前颧骨、端头过长、鼻孔前倾、胸腰椎后凸和手短及心脏异常。TKS4的缺失也会干扰骨骼形成，最终会导致骨质疏松症[21]，表明功能失调的TKS4很可能与FTHS表型的发展有关。同时TKS4突变导致Borrone皮肤骨骼-心脏骨骼综合征（Borrone dermato-cardio-skeletal syndrome，BDCSS），其特征是心脏二尖瓣发育缺陷，由于细胞骨架结构的缺陷导致组织内细胞运动能力受损，可见TKS4对于机体正常功能调控的重要性[22]。TKS4的过表达促进了肿瘤侵袭、血管生成及疾病发展，TKS4的缺失造成了机体功能发育不全。

TKS4在生理和病理情况下发挥着相反的作用机制，在生理情况下是调控机体生长发育的重要因子之一，在病理情况下则促进了肿瘤的发生、发展，体现出促癌基因的作用。在未来肿瘤疾病研究中，该因子可能成为潜在的应用靶标，对临床个性化治疗提供帮助。

2.4 TKS4相关机制研究

在生理情况下TKS4表现为良性调控蛋白，在机体功能和发育中起正调控作用。研究表明[13]，TKS4在足小体形成、细胞产生ROS以及白色脂肪组织的分化中发挥重要正向作用。例如，在骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）中，TKS4是成脂分化和成骨分化的潜在调节因子，同时也参与正常胚胎细胞的发育，发挥十分重要的正向调控机制[12,14,23]。Mehes等[20]认为TKS4是足小体和片状脂质体中细胞骨架结构的关键组织者之一，对于调节细胞的迁移和侵袭力是必不可少的因子。Vas等[24]通过近交小鼠图谱分析，得出TKS4是颅面骨形态正常发育的必需因子。Szeder等[25]认为TKS4是一种新上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的调控因子，它通过改变EMT来调控TKS4的表达水平而发挥作用。

TKS4的功能研究表明其在正常机体发育中是不可或缺的重要调节因子，为相关功能性疾病缺陷研究提供了重要的理论支持，也为药物研发和靶向治疗提供了依据和参考。

3 TKS5与肿瘤

目前对TKS5在好发肿瘤中的研究较广泛，已知在胶质性脑肿瘤、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等中均高表达，具有一定的临床意义。

3.1 TKS5与乳腺癌

乳腺癌是发生于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，其病因尚未完全清楚。研究发现乳腺癌的发病存在一定的规律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。研究表明，通过对Src-3T3纤维肉瘤细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞在TKS5基因敲除前后的生长分析显示，该肿瘤的血管生成减少，凋亡率增加，肿瘤生长速度变缓慢，说明该基因在乳腺癌发生、发展中发挥了促癌基因的作用[27]。Blouw等[32]通过免疫组织化学和RNA测序的方法，分析TKS5在乳腺癌进展中的作用，得出TKS5在约50%的原发性浸润性乳腺癌患者中高表达，此外，TKS5高表达与不良预后相关，特别是在Ⅰ/Ⅱ期疾病晚期复发患者中，为TKS5在乳腺癌中的作用机制及后续研究提供了理论支撑。

3.2 TKS5与前列腺癌

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，通常与家族遗传关系密切。Caires-Dos-Santos等[17]分析，层粘连蛋白C16刺激Src和支架蛋白TKS4和TKS5的表达，促进了前列腺癌的侵袭力。Burger等[26]用免疫组化方法检测92例前列腺组织和正常前列腺组织中的TKS5，同时对野生型和突变型Src和TKS5在LNCAP和PC-3前列腺癌细胞系中的表达和活性进行调控，确定Src-TKS5信号在内胚层发育、基质重塑活动、转移和侵袭中的作用，得出在高GLEASON评分的前列腺肿瘤标本和侵袭性前列腺癌细胞系中，Src被激活，TKS5被上调，提示了Src-TKS5信号在前列腺肿瘤进展中的一般作用及TKS5可能作为该疾病分期的标记因子之一。

3.3 TKS5与肺癌

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研究发现TKS5有 3种亚型，即 TKS5α（TKS5long）、TKS5β和TKS5short[27]。Li等[28]分析了 TKS5long和 TKS5short与肺腺癌的相关型，发现TKS5long高表达和TKS5short低表达与肺腺癌患者的转移进展相关，并可以作为预测早期疾病患者的生存不良指标之一，提示TKS5long到TKS5short表达可以作为评估原发肿瘤转移潜能和识别早期患者的预后指标，通过抑制TKS5long功能或增强TKS5Short活性的分子治疗策略，未来可能有助于抑制肿瘤转移进展。

肿瘤中TKS5的高表达与患者预后的关系极为紧密，可以进一步为临床研究提供理论和用药上的支撑。同时，对好发肿瘤的研究表明TKS5可能是潜在的分子指标，在未来肿瘤的靶向治疗中意义极大。

3.4 TKS5的靶向研究

靶向治疗，是在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点的治疗方式。研究表明[19,29]TKS5β和TKS5Short在胚胎成纤维细胞中高表达，Tks5α则在癌细中广泛表达，对于TKS5及亚型在癌细胞中的研究可提供理论参考。在腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）中，TKS5的表达可导致胃癌细胞的侵袭，同时还可以促进癌细胞黏附于腹膜表面促进癌细胞在腹壁生长，表明TKS5可能是预防腹膜癌的潜在靶点[30]，为开发抑制腹膜癌播散的药物提供了理论支持。TKS5的表达还可诱导肿瘤血管生成[32]，在侵袭性癌细胞中，TKS5过度表达与侵袭程度有关，同时TKS5过度表达的肿瘤的转移率也较高[3,11]。Stanley等[31]通过对免疫组织化学实验和ONCOMIN数据库信息的挖掘发现，与卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌的原发肿瘤相比，转移性肿瘤中TKS5 mRNA表达增强的程度更高，且在一些肿瘤的转移事件增加和预后较差的癌症中的过度表达之间存在很强的相关性，TKS5可作为相关预后标志物在癌症中的潜在因子，对未来的靶向治疗具有重要的理论参考价值。Iizuka等[19]用组织芯片技术发现TKS在黑色素瘤中高表达，在转移性黑色素瘤中的表达高于原发黑色素瘤，且TKS5水平随疾病进展而增加，可作为黑色素瘤靶向治疗和预后的指标提供参考。

上述研究表明TKS5是一个促癌因子，其高表达与肿瘤发生、发展关系密切，可能参与相关的信号通路，作为预后指标的潜能极大，对于日后相关机制研究和靶向药物治疗提供了参考。

3.5 TKS5的相关机制研究

研究表明，TKS5缺失阻碍了斑马鱼体内神经嵴细胞从背侧到腹侧的迁移和足体突起的形成，最终导致斑马鱼发育缺陷，表明TKS5是胚胎发育过程中神经嵴细胞迁移的必需分子之一[14,33]。在小鼠实验中，以TKS5基因为靶点的基因陷阱导致TKS5α丢失，新生小鼠死亡，并伴有明显的腭部形成缺陷，进一步支持了TKS5在神经嵴衍生细胞类型中的作用，表明了TKS5亚型对于哺乳动物机体发育的重要性[27]。

综上所述，TKS5可能是一个潜在的癌症预后指标，同时也是相关的分子靶点，在未来抗癌药物研发中，有望对携带TKS5过表达肿瘤的患者进行个性化治疗提供帮助。

4 TKS4、TKS5与EGF信号通路

TKS4和TKS5属于Src家族，同时也被认为是表皮因子生长受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和其他受体下游分子传递信号的成员，对正常细胞和肿瘤细胞足小体、侵袭性伪足的形成发挥重要作用[8]。Vas等[12]分析得出TKS4在表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）信号转导过程中为信号转导建立了平台，使得TKS4及其下游信号是脂肪细胞功能和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptorr-gamma，PPARγ）介导的白色脂肪向米色脂肪组织转化新的调控因子。同时TKS4可能通过延迟信号转导或改变其动力学，在EGF通路中发挥潜在的负调控作用。Bögel等[35]证明TKS4通过与EGFR形成复合物而参与EGF信号通路，并在EGF刺激下使酪氨酸磷酸化，促进细胞迁移。Fekete等[13]认为TKS5是EGF信号通路的新成分，EGF介导细胞导致TKS5磷酸化水平的持续升高并转移到质膜上，并且调节肌动蛋白细胞骨架的重排，从而形成侵袭伪足造成细胞迁移。研究表明[26,36-37]Src在人Y558或Y620残基上磷酸化的TKS5对于TKS5α介导侵袭性伪足形成和癌细胞侵袭力以及神经嵴细胞迁移和足小体形成至关重要。

TKS4和TKS5参与EGF信号通路的调控，是否调控了上下游相关蛋白，是否参与某种疾病的发生机制，尚有待探讨。

5 结语

TKS4和TKS5作为TKS经典亚型蛋白，在肿瘤方面的研究有一定进展，但其分子机制尚不明确。对其结构和功能的研究表明，TKS4和TKS5对于侵袭性伪足的形成、癌细胞的体外侵袭和体内肿瘤生长都是必需的因子，同时在机体正常功能发育中也不可或缺，两者的功能部分重叠。大量研究表明TKS4和TKS5是靶向治疗及药物开发研究中的关键因素，但两者在肿瘤和临床中的研究还不够深入，癌细胞利用侵袭性伪足进行侵袭和转移的生物学行为是否普遍，是否具有极高的临床意义，有待进一步探讨。