吸血动物和蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂功能研究进展

朱明儒，吴若男，肖蓉

辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）是一类普遍存在于病毒、细菌、原生动物、植物和哺乳动物体内的蛋白酶抑制因子，能够与半胱氨酸蛋白酶可逆地竞争性结合并抑制其活性，从而参与调节机体多种生理和病理过程，如蛋白质分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭和转移等[1-2]。早在1968年，Fossum和Whitaker两位学者从鸡蛋清中分离得到一种能够抑制无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肽酶活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂[3]；随后，Anastasi等首次采用亲和层析法分离得到该蛋白酶抑制剂的纯品，将其命名为cystatin[4]。此后，陆续有学者相继从不同物种中分离得到多种cys-tatin成员，从而构成一个庞大的cystatin超家族。

根据序列相似性、对蛋白酶活性抑制强弱以及是否存在二硫键，cystatin超家族成员可分为3类，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[5]。Ⅰ型又称stefin（胱抑蛋白）家族，主要为细胞内蛋白质。每个成员约由98个氨基酸残基组成，相对分子质量（Mr）约11 000，无二硫键和糖基化侧链，分布于上皮细胞和多形核白细胞内，代表成员如人类stefin A和B。Ⅱ型又称cystatins家族，是cystatin超家族的主要代表，为分泌性蛋白质。每个成员约由120个氨基酸残基组成，Mr约为14 000，含有2个链内二硫键，并且含有1个在胞外定位的信号肽，主要存在于体液中。该家族成员能抑制木瓜蛋白酶样超家族的半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、H和L[6]。另外，有些Ⅱ型cystatins成员，如cystatin C、E/M和F还能抑制哺乳动物的天冬酰胺内肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）活性，并在机体免疫过程中阻碍AEP参与抗原的加工与呈递[7]。Ⅲ型又称为kininogens（激肽原）家族，为分泌性单链蛋白质，主要存在于血浆及分泌液中。kininogens家族成员由多个Ⅱ型cystatin样结构域组成，含有多个二硫键及糖基，Mr为60 000～120 000[8]。cystatin超家族成员在空间结构上高度相似，都含有保守的疏水结构域，即靠近N端的甘氨酸（Gly）、第一个发夹环Q-X-V-X-G区域（有些成员为Q-X-X-X-G序列），以及第二个发夹环脯氨酸和色氨酸（P-W）。cystatin超家族成员通过这3个基序以非共价键结合蛋白酶，从而阻断蛋白酶活性位点与其作用底物的结合。由于cystatin并不直接嵌入酶的活性中心，因此最终形成可逆的、紧密结合的酶-抑制剂复合物[9-10]。

1 吸血动物cystatin超家族成员功能研究进展

1.1 蜱虫cystatin超家族成员功能研究进展

已有研究显示cystatin在蜱虫的生长发育、吸血、血红蛋白消化以及对宿主免疫系统的调节过程中起着非常重要的作用。目前，研究发现蜱虫主要含有2种类型的cystatin超家族成员，分别属于Ⅰ型和Ⅱ型。近年来，已经有大量研究对来自不同硬蜱和软蜱的多种cystatin分子进行了鉴定分析，并探究了其在蜱虫生理中的作用。

蜱虫Ⅰ型stefin家族成员缺乏信号肽，为细胞内蛋白质，参与调节蜱虫的生长发育及细胞内血红蛋白的消化过程。2006年，Lima等从微小牛蜱（Boophilus microplus）的脂肪体cDNA文库中鉴定出一种Ⅰ型stefin家族成员，命名为Bmcystatin。半定量PCR和Western印迹分析表明Bmcystatin不仅存在于微小牛蜱的脂肪体中，还存在于其唾液腺及卵巢中[11]。序列分析表明Bmcystatin与来自肩突硬蜱（Ixodes scapularis）唾液的Ⅰ型stefin家族成员具有70%的序列一致性。除了能够抑制组织蛋白酶L，Bmcystatin还对微小牛蜱中半胱氨酸内肽酶的活性具有抑制作用。由于该半胱氨酸内肽酶可降解卵黄素，因此作者推测Bmcystatin在蜱虫胚胎发育过程中具有重要作用[11-12]。

2009年，Zhou等从长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）肠上皮细胞中鉴定出一种Ⅰ型stefin家族成员，并经原核表达得到重组蛋白Hlcyst-1（cystatin from tickH.longicornis）。序列分析表明Hlcyst-1与Bmcystatin具有79%的序列一致性。Hlcyst-1对组织蛋白酶B和H表现出较小的抑制活性[13-14]。但是，Yamaji等发现Hlcyst-1在长角血蜱中可以抑制一类组织蛋白酶L样的半胱氨酸蛋白酶（H.longicorniscathepsin L-like，HlCPL-A）。由于HlCPL-A能够降解牛血红蛋白，因此Hlcyst-1可有效抑制HlCPL-A的血红蛋白分解活性。在长角血蜱的吸血过程中，Hlcyst-1和HlCPL-A的转录水平不断上调，并在48 h达到最高水平。因此，Yamaji等推测Hlcyst-1可以协同HlCPL-A调控蜱虫血液消化的过程[15-16]。

近年来，对蜱虫Ⅱ型cystatins家族成员的研究较多。通常，Ⅱ型cystatins家族成员在蜱虫的中肠和唾液腺组织中分泌表达。2010年，Yamaji和Zhou等陆续从长角血蜱的中肠和唾液腺组织中鉴定出3种Ⅱ型cystatins家族成员，即Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1[15-17]。其中Hlcyst-2、Hlcyst-3主要源自长角血蜱的中肠组织，而HlSC-1则是在长角血蜱的唾液腺中被鉴定出来。酶活测定结果表明Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1都对木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L具有抑制活性，且Hlcyst-2还可抑制组织蛋白酶H的活性。长角血蜱经血液喂养后，Hlcyst-2转录产物不仅主要存在于长角血蜱所有发育阶段的中肠组织中，还存在于其血细胞和唾液腺中，且表达水平随着长角血蜱的发育阶段而不断增加[15]。与Hlcyst-1一样，Hlcyst-2可以通过抑制HlCPL-A的活性来阻止其对血红蛋白的降解，这表明Hlcyst-2也可参与调控长角血蜱的血液消化及发育过程[15]。此外，将细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）注射到成年长角血蜱后，Hlcyst-2转录产物上调。这意味着Hlcyst-2还可能参与调节蜱虫的天然免疫过程[13]。

迄今，在蜱虫中发现较早且研究最多的Ⅱ型cystatins成员是来自肩突硬蜱唾液腺的sialostatin L和L2。这2种蛋白具有75%的序列相似性，且二者都可抑制组织蛋白酶L和S的活力[18]。在角叉菜胶诱导的小鼠爪水肿模型中，sialostatin L可通过抑制小鼠细胞毒性T淋巴细胞系CTLL-2的增殖进而降低小鼠爪水肿的程度。这表明sialostatin L具有抗炎活性[19]。另外，sialostatin L还可强烈抑制Th9淋巴细胞产生白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-9。通常，宿主在遭受到寄生虫感染时，可产生IL-9，同时，产生的IL-9可通过进一步促进肥大细胞生长来促使宿主产生免疫应答反应以保护宿主免受寄生虫的入侵。如果IL-9在宿主体内的产生减少，寄生虫在宿主体内就更易存活。这就意味着在肩突硬蜱的寄生过程中，sialostatin L可通过抑制IL-9的产生来有效阻止宿主的免疫反应以保证其在宿主体内的存活[20]。因此，在不久的将来，sialostatin L的这一特性可用来开发治疗过敏性和自身免疫疾病的新药。此外，还有研究报道IL-9主要参与诱导哮喘的形成。在小鼠实验性哮喘模型中，sialostatin L还可通过抑制IL-9的产生进而几乎完全消除了小鼠的气道高反应性（airway hyper reactivity，AHR）以及嗜酸性粒细胞增多的症状[21]。这表明sialostatin L还具有治疗哮喘疾病的作用，这也为今后研发治疗哮喘疾病的新策略及新药筛选提供了线索。

尽管有效抑制宿主的免疫反应对蜱虫的摄食成功至关重要，但是，在抑制宿主免疫反应的同时，蜱虫还可在宿主体内大肆传播病原体。Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）主要由树突状细胞（dendritic cells，DC）产生，在宿主防御蜱虫传播病原体的过程中至关重要。目前研究发现sialostatin L2可通过抑制信号传导及转录激活因子1/2（signaltransducersand activatorsoftranscription-1/2，STAT-1/2）的磷酸化进而干扰IFN触发的信号转导。这样，伯氏包柔螺旋体（Borrelia burgdorferi）便在sialostatin L2的保护下在宿主体内传播，最终可引起莱姆病。因此，sialostatin L2不仅是蜱虫摄食成功的关键因素，同时也是病原体在宿主体内传播的关键靶点[22]。同时，还有报道称sialostatin L2可通过抑制巨噬细胞还原型辅酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）来促进其细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，从而抑制caspase-1的激活及其介导的炎症反应，最终在阻断宿主免疫应答方面发挥重要作用[23]。

2006年，Grunclová等从来自非洲钝缘蜱（Ornithodoros moubata）的cDNA文库中分离鉴定出2种Ⅱ型cystatins成员，分别是Om-cystatin 1和Om-cystatin 2。经原核表达后，重组蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可有效抑制木瓜蛋白酶及组织蛋白酶B、C、H的活性[24]。LPS刺激DC后，重组蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可抑制DC分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 IL-12，并减少由 DC诱导的抗原特异性CD4+T细胞的增殖，从而参与机体的免疫应答反应[25]。与sialostatin L相似，Om-cystatin 2还能够强烈抑制组织蛋白酶L和S的活性。不过，Om-cystatin 2对组织蛋白酶B、C、H的抑制效率比sialostatin L更高[26]。此外，Omcystatin 2和sialostatin L还可与组织蛋白酶S发生相互作用，即通过抑制组织蛋白酶S的活性进而抑制DC的成熟，阻断宿主的免疫反应，从而使蜱虫能够轻松寄生在宿主体内，吸食血液。此外也有研究报道，降低Om-cystatin 2和sialostatin L2的表达会显著抑制蜱虫的摄食能力[27]。这表明Om-cystatin 2可协同sialostatin L2参与调控蜱虫的进食过程。

2015年，Wei等先后从镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）的cDNA文库中鉴定出2种cystatin成员，分别是Ⅰ型stefin成员RHcyst-1和Ⅱ型cystatins成员RHcyst-2。在蜱虫的不同发育阶段，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）结果显示RHcyst-1在卵中的表达量最高，且RHcyst-1经基因沉默后会显著降低蜱虫的产卵率。这表明RHcyst-1可能参与调控蜱虫的早期胚胎发育过程。此外，与未吸血的蜱虫相比，RHcyst-2在吸血蜱虫所有组织中的表达均明显上调。这表明RHcyst-2参与调节蜱虫的吸血过程。原核表达的RHcyst-1和RHcyst-2重组蛋白都对组织蛋白酶L、B、C、H、S以及木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性具有明显的抑制作用[28-29]。由于目前研究证实组织蛋白酶L、S在肿瘤细胞的侵袭和迁移中发挥关键作用[30-31]，是控制肿瘤细胞转移的有效靶点，因此，组织蛋白酶L和S的抑制剂，如RHcyst-1，应具有潜在的抗肿瘤转移活性。随后，Wei等发现RHcyst-1可有效抑制人宫颈癌HeLa、肺癌A549、卵巢癌SKOV-3和小鼠黑色素瘤B16F10等4种不同肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在体内动物实验中，将小鼠黑色素瘤B16F10细胞移植入C57BL/6小鼠体内，同时将RHcyst-1直接注射至黑色素瘤内部后，荷瘤小鼠肿瘤的生长被显著抑制。同时，RHcyst-1不仅对小鼠体内其他组织器官无毒性，还可提高荷瘤小鼠的存活率[32]。因此，RHcyst-1将有可能成为治疗人宫颈癌、肺癌、卵巢癌和小鼠黑色素瘤等肿瘤疾病的重要候选药物。

2017年Rangel等从全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）中分离出3种新型cystatin家族成员，分别命名为JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c。序列分析表明JpIpcys2b基序保守，具有Ⅱ型cystatins家族成员的典型特征，而在JpIpcys2a和JpIpcys2c序列中则存在不同于Ⅱ型家族成员典型特征的突变。蛋白质-蛋白质对接模拟实验进一步揭示了JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c与人组织蛋白酶L的结合位点保守，并且，该结合位点均覆盖了活性位点裂口，可以有效阻止底物进入蛋白酶催化区域。其中，JpIpcys2a与人组织蛋白酶L结合可形成较为稳定的复合物，而JpIpcys2b和JpIpcys2c与人组织蛋白酶L结合形成的复合物稳定性则较低。同时，活性检测结果表明JpIpcys2a对组织蛋白酶B、C、L均具有抑制作用，其中对组织蛋白酶B和L的抑制效果较为明显。此外，RT-PCR结果表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c转录本存在于全沟硬蜱的不同组织和幼虫发育时期中，这表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c广泛参与全沟硬蜱的发育过程[33]。系统发育树表明JpIpcys2a与肩突硬蜱的sialostatins L和L2亲缘关系较近。这表明JpIpcys2a可能同样具有抗炎活性以及抑制细胞毒性T淋巴细胞增殖的功能。Parizi发现抗重组 BrBmcystatin2b（rBrBmcys2b）、重组 BrBmcystatin2c（rBrBmcys2c）或重组 JpIpcys2a（rJpIpcys2a）的血清能够识别微小牛蜱的唾液、唾液腺、卵巢、肠道、脂肪体以及幼虫中的天然cystatin，但程度不同。其中，抗rBrBmcys2c血清能识别部分充血雌性微小牛蜱肠道、卵巢、唾液腺和脂肪体组织中的cystatin，抗JpIpcys2a血清可以识别部分充血和完全充血的雌性微小牛蜱唾液腺中的cystatin以及rBrBmcys2b，而抗rBrBmcys2b可以识别以上所有组织中的天然cystatin[34-35]。上述结果证明这些重组cystatin与天然cystatin之间存在交叉抗原性。借此，JpIpcys2a、BrBmcys2b和BrBmcys2c可作为抗蜱疫苗的抗原，具有潜在应用前景。

综上所述，蜱虫cystatin家族成员不仅具有cystatin超家族典型的生物学功能，既可抑制半胱氨酸类蛋白酶的活性，还在蜱虫的生长发育、寄生吸血、血液消化、应对宿主免疫调节以及抗肿瘤等方面发挥重要作用。因此，对蜱虫cystatin家族成员作用机制的深入研究，不仅可为今后有效防治寄生虫奠定理论基础，还可为开发新型的抗炎以及抗肿瘤药物提供线索。

1.2 水蛭cystatin超家族成员功能研究进展

水蛭又名蚂蟥，主要以吸食动物血液为生。不过遗憾的是，迄今关于环节动物先天性免疫调控作用机制的研究还相对较少。2004年，Lefebvre等首次采用大肠杆菌和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）混合菌刺激整嵌晶蛭（Theromyzon tessulatum），并对其进行转录组学研究，以鉴定挖掘免疫应答反应的相关功能基因。在鉴定出来的64种功能基因中，Lefebvre等克隆并表达了与哺乳动物stefin B具有较高同源性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B，并将其命名为Tt-cysb。分析表明Tt-cysb与人类stefin B具有54%的序列一致性。原位杂交和免疫细胞化学结果表明Tt-cysb仅在水蛭的大型体腔细胞中表达，且其表达量在经混合细菌处理后的24 h内持续上调[36-37]。这表明Ttcysb可能参与调节水蛭内组织蛋白酶的活性，并在水蛭的免疫应答调节中起重要作用。

1.3 七鳃鳗cystatin家族成员功能研究进展

七鳃鳗隶属于圆口纲，具有独特的半寄生生活习性。2016～2018年，李博文和Zhu等对不同进食时间的中国东北七鳃鳗（Lampetra morii）口腔腺分泌液进行比较蛋白质组学研究，从中鉴定出半胱氨酸蛋白酶抑制剂F（L.moriicystatin F，Lmcystatin F）基因。由于Lm-cystatin F仅存在于进食后东北七鳃鳗的口腔腺分泌液中，因此推测Lm-cystatin F可能参与调控了东北七鳃鳗的吸血进食以及免疫防御等过程[38-39]。序列分析表明来自东北七鳃鳗口腔腺的Lm-cystatin F含有信号肽和二硫键等特征，隶属于Ⅱ型cystatins家族。前21位氨基酸为信号肽（MSRVASLSLLLCGLCYFCCEA），29（P）～139（Q）位氨基酸为cystatin样功能结构域。三维模拟结果表明Lm-cystatin F含有L1和L2等2个成环结构，2对二硫键，包含1个α螺旋和5个β折叠[38-39]。

重组Lm-cystatin F以剂量依赖性的方式抑制木瓜蛋白酶的活性，因此，李博文和Zhu等推测Lm-cystatin F具有cystatin超家族成员典型的生物学功能。此外，重组Lm-cystatin F能够抑制人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、黏附于多种细胞外基质蛋白质、迁移、浸润以及体外小管形成，因而具有抗血管新生功能[39]。

2 蛇毒cystatin超家族成员功能研究进展

cystatins是存在于蛇毒中的一类具有多种生物活性的小分子蛋白质[40]。目前，蛇毒来源的cystatin超家族成员均隶属于Ⅱ型cystatins家族。1987年，Evans等首次从鼓腹咝蝰（Bitis arietans）蛇毒中分离得到cystatin超家族成员，将其名命为puff-adder[41]。随后，Michele等从台湾眼镜蛇（Naja naja atra）毒液中分离出一种新的Ⅱ型cystatins家族成员，命名为眼镜蛇半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cobra cystatin）[42]。序列分析表明cobra cystatin与puff-adder具有73%的同源性。酶活实验表明puff-adder和cobra cystatin均能抑制木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B的活性[41-42]。由于前期研究证实抑癌基因cystatin M（人源）也可以同样特异性地抑制半胱氨酸蛋白酶中组织蛋白酶B的活性，且其表达若发生下调则会通过增强组织蛋白酶B的活性进而促进癌细胞的浸润和转移[43]，因此研究人员推测蛇毒cystatin超家族成员也很有可能参与调控肿瘤的发生及发展进程。

2002年，陈兵发现来自中华眼镜蛇（Naja atra）蛇毒的小分子cystatin（snake venom cystatin，sv-cystatin）可显著竞争性抑制木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B的活性。氨基酸序列分析结果提示svcystatin与人源cystatin M具有高度相似性，因此陈兵推测sv-cystatin可能具有抗肿瘤侵袭及转移的潜在功能[44]。由于蛇毒中sv-cystatin的含量相对较少，且其分离提纯步骤过于繁琐，因此宋军及万榕等先后通过构建pET-42a/GST-cystatin原核表达载体，并经大肠杆菌原核表达获得可溶性重组sv-cystatin；构建pcDNA3.1/sv-cystatin真核表达载体，并经脂质体转染导入相关癌细胞；以及运用巴斯德毕赤酵母真核表达体系表达重组svcystatin等方法来大批量生产、纯化该蛋白，从而进一步了解sv-cystatin的多种生物学功能和潜在的作用机制[45-47]。除了能够抑制半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B的活性，体外及体内实验均证实利用以上2种表达方法（大肠杆菌原核表达和巴斯德毕赤酵母真核表达）而得到的重组sv-cystatin均可有效抑制小鼠黑色素瘤B16F10及肝癌MHCC97H细胞的侵袭和转移。与重组sv-cystatin结果相似，sv-cystatin转染至B16F10及MHCC97H细胞后均可在体外及体内抑制上述肿瘤细胞的侵袭和转移[48-51]。目前大量研究发现，肿瘤细胞可分泌多种蛋白水解酶，如半胱氨酸蛋白酶，并通过对细胞外基质以及基底膜的降解，从而在肿瘤的侵袭及转移过程中发挥非常重要的作用[52]。因此，侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，同样也是导致肿瘤患者死亡的主要原因。而sv-cystatin作为半胱氨酸蛋白酶的有效抑制剂，可能通过阻碍半胱氨酸蛋白酶对细胞外基质和基底膜的降解，从而有效抑制肿瘤的侵袭与转移。因此，谢群等提出sv-cystatin可作为抗癌治疗的潜在候选药物[48-51]。

研究发现肿瘤转移抑制基因NM23（non-metastasis 23）可编码生成核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinases，NDPK）。作为目前研究较多的抑制肿瘤转移的蛋白质，NDPK最早从小鼠黑色素瘤细胞中筛选得到，其在低转移细胞株中的表达强度是高转移细胞株内的10倍。目前研究证实NDPK可以结合多种小G蛋白和三聚体G蛋白，并抑制G蛋白水解三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）为二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP），从而抑制蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）膜转位，由此发挥其抑制肿瘤侵袭和转移的作用。另外，NDPK还可与微管蛋白结合，通过调节微管结构而影响细胞结构和迁移，进而抑制肿瘤细胞侵袭和转移[53-54]。2011年，齐元麟等发现sv-cystatin能够显著上调小鼠黑色素瘤细胞中NM23的表达，并由此推断sv-cystatin可能通过调控NM23的表达来抑制肿瘤的侵袭及转移[55]。

2013年，谢群等在体外实验中发现重组svcystatin处理人肝癌MHCC97H细胞后，可下调MHCC97H细胞内转化生长因子β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的转录水平及蛋白表达。由于TGF-β2是一类多功能的细胞因子，在肿瘤的发生、发展中发挥重要的促进作用，因此sv-cystatin处理MHCC97H细胞后，可通过抑制TGF-β2的转录和表达，进而阻碍TGF-β2与其受体的结合，最终阻断其胞内下游Smads信号转导通路，从而抑制肿瘤的转移；同时，sv-cystatin还可通过抑制TGF-β2介导的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从而抑制肿瘤的发生发展[56-57]。此外，TNF-α可与细胞内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等细胞生长因子协同作用来诱导肿瘤形成新血管。并且，目前TNF-α已经成为抗血管生成作用的有效靶点而用于肿瘤治疗[58]。因此，sv-cystatin还可通过下调TNF-α的转录和表达来发挥其抗血管新生作用，从而抑制肿瘤的生长。

目前，研究发现血管在肿瘤生长和转移过程中发挥了非常重要的作用。不过，仅仅依赖于内皮细胞形成的血管是无法满足肿瘤生长过程中所需要的血液供应。最近研究发现，在恶性肿瘤组织中，肿瘤细胞可通过自身变形，并与细胞外基质相互作用，以模拟血管壁结构而形成由一层肿瘤细胞而不是由内皮细胞构成的拟态血管（血管生成拟态，vasculogenic mimicry，VM）。由于VM为肿瘤的生长和转移提供了更为充足的血液供应，因此VM在多种恶性肿瘤组织中均有发现，如卵巢癌、肝癌及胃癌等[59]。与未出现VM的肿瘤细胞相比，在VM周围的多种肿瘤细胞中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2与MMP9的含量都相对较高。MMPs是一组Zn2+依赖性肽酶，能够降解多种细胞外基质以及基底膜中多种胶原成分，包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹力蛋白及蛋白聚糖等，因此MMPs在肿瘤侵袭、转移及血管生成中发挥着至关重要的作用[60-62]。2010年，Robertson等发现在形成VM的乳腺癌细胞中，MMP2和MMP9的蛋白含量明显高于未出现VM的乳腺癌细胞[63]。由此表明MMP2和MMP9与VM的形成有紧密关系。2011年，Tang等发现sv-cystatin基因转染至肝癌MHCC97H细胞后可以抑制MMP2与MMP9的活性，因此推测sv-cystatin可能是通过抑制肝癌MHCC97H细胞内MMP2和MMP9的活性从而减少其对细胞外基质的降解，进而减少VM的形成，最终抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[50]。除了形成VM，肿瘤细胞还可分泌大量血管生长因子，通过激活血管内皮细胞信号传导通路，导致血管内皮细胞的异常增殖，最终形成提供营养供给的新生血管。例如，VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是2种重要的血管生长刺激因子，可同内皮细胞上血管内皮生长因子受体（fms-like tyrosine kinase，flt-1）结合，通过激发内皮细胞信号转导途径，从而促进内皮细胞的增殖、迁移、细胞外基质的降解以及侵袭基底膜，最终形成新的血管。2013年，Xie等研究表明重组sv-cystatin还能明显抑制小鼠黑色素瘤B16F10细胞和肝癌MHCC97H细胞分泌VEGF和bFGF，并显著抑制内皮细胞HUVECs中flt-1的表达，从而最终抑制肿瘤内新血管的生成[64]。

此外，谢群等还发现重组sv-cystatin可以通过诱导肝癌MHCC97H和小鼠黑色素瘤B16F10细胞发生凋亡来抑制肿瘤的生长。重组sv-cystatin促使MHCC97H及B16F10细胞释放活性氧，并通过活化caspase-2来破坏线粒体功能，即将线粒体内的细胞色素C（cytochrome C）释放至细胞质中。细胞色素C的释放是线粒体凋亡路径的重要一环。被释放入细胞质的细胞色素C通过自我剪切可以活化并启动caspase级联反应，从而激活其下游的凋亡执行者caspase-3，最终引起细胞凋亡。另外，Western印迹分析表明重组sv-cystatin还能抑制抗凋亡基因BCL2的表达，并同时促进促凋亡基因BAX的表达。BCL2和BAX作为线粒体凋亡途径上的重要调控蛋白，相互结合、彼此抑制，共同影响细胞凋亡的发生与发展[48]。因此，上述结果意味着sv-cystatin可通过线粒体途径诱导MHCC97H和B16F10细胞凋亡。

到目前为止，sv-cystatin是研究相对较多且较为深入的来自蛇毒的cystatin超家族成员。综上所述，sv-cystatin抑制肿瘤细胞转移机制为：svcystatin首先通过抑制半胱氨酸蛋白酶的活性从而抑制其对细胞外基质及基底膜的降解，最终抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。其次，sv-cystatin还可通过上调NM23的表达，抑制肿瘤的侵袭及转移。第三，sv-cystatin通过下调TGF-β2转录水平及蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的转移及上皮间质转化。此外，sv-cystatin还可通过抑制肿瘤内VM及血管新生来阻断肿瘤细胞的营养供给，其作用机制为：首先sv-cystatin可通过抑制MMP2和MMP9的活性，减少其对细胞外基质的降解，进而减少VM的形成；其次，sv-cystatin可通过下调TNF-α、VEGF、bFGF及flt-1受体的表达来抑制肿瘤内新生血管的形成。最后，sv-cystatin还可通过线粒体途径诱导肿瘤细胞发生凋亡来抑制肿瘤的生长。因此，sv-cystatin有望成为具有抗肿瘤功能的新型候选药物。

除了sv-cystatin，Richards等在2011年通过KM71H毕赤酵母表达系统重组表达了来自澳大利亚低地铜斑蛇（Australian lowland copperhead）蛇毒中的Ⅱ型cystatins成员AsCystatin，并预测其Mr为13 087。与人cystatin C相似，重组AsCystatin同样可抑制组织蛋白酶B、L以及木瓜蛋白酶的活性[65]。不过，AsCystatin是否与sv-cystatin一样具有多种生物学功能，还须进一步探索。

综上所述，来源于吸血动物及蛇毒的cystatin成员隶属于Ⅰ型和Ⅱ型cystatins家族，具有该家族典型的生物学功能，即能够抑制多种半胱氨酸类蛋白酶的活性。同时，上述cystatins成员还能够广泛参与调节吸血动物的生长发育、寄生吸血、血液消化、应对宿主免疫调节以及抗肿瘤等功能。