基因工程方法增加微藻脂质积累研究进展

李俊磊，张红兵

(河北经贸大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061)

随着经济发展和人口增长，人们对能源的依赖日趋加剧，但石油、天然气等石化能源燃烧会产生大量的CO2，加速温室效应，产生的NO2、SO2和PM 2.5会造成大气污染，成为亟待解决的问题。以生物油脂为原料生产的生物柴油(脂肪酸甲酯)含硫低、润滑好、易燃烧，有替代传统柴油的潜力，成为近年来生物能源研发的热点。与传统能源作物大豆、玉米、油菜、麻风树等相比，微藻生长速率快、适应性强、不占用耕地，可与废气废水治理相结合，是理想的生物能源制备原料。

微藻的油脂含量是影响终产品成本的关键因素之一，目前微藻型生物柴油的价格较高，难以推动其商业化应用。随着人们对微藻脂质合成与代谢途径研究的不断深入，从现有微藻出发，利用基因工程方法对相关基因进行改造，增加微藻脂质积累水平，相比传统的微藻培养优化无疑是一条捷径。本文从微藻脂质的合成途径出发，综述了国内外利用基因工程技术改造微藻，提高脂质积累的方法，并对应用前景进行了展望。

1 TAG的合成途径

TAG是微藻中组成中性脂质的主要成分，在藻细胞处于静止生长期或压力条件下容易积累。TAG在酸、碱或酶等存在的条件下，可以与甲醇进行酯交换生成生物柴油和甘油。微藻内TAG的合成可分为叶绿体内脂肪酸合成途径、游离脂肪酸跨膜、内质网上的Kennedy途径和包装油脂小滴四个阶段。其中脂肪酸合成途径和Kennedy途径是TAG合成的关键，调控这两个途径是提高微藻脂质积累的突破口。

1.1 脂肪酸合成途径

1.2 Kennedy途径

脂酰辅酶A(acyl-CoA)和3-磷酸甘油(G3P)是Kennedy途径的直接前体，acyl-CoA由穿过叶绿体膜的FFA经脂肪酸硫激酶催化形成，G3P由磷酸二羟基丙酮(DHAP)经3-磷酸甘油脱氢酶(G3PDH)催化产生。甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)催化acyl-CoA的脂酰基转移到G3P的sn-1位，酯化生成溶血磷脂酸(LPA)。溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)继续催化LPA的sn-2位酯化生成磷脂酸(PA)。PA在磷脂酸磷酸酶(PAP)的作用下脱去磷酸形成二酰甘油(DAG)。最后DAG在二酰甘油酰基转移酶(DGAT)作用下sn-3位酯化形成TAG。

2 基因工程方法增加微藻脂质积累

生物信息学研究发现微藻与植物的脂质合成过程高度相似，可借鉴现有高等植物对TAG合成的研究结果，利用基因工程方法从增强脂肪酸合成、增强Kennedy途径和抑制脂肪的合成竞争三类途径提高微藻脂质的积累。

2.1 增强脂肪酸合成途径

脂肪酸合成途径中的关键酶主要包括PDH、ACCase、FAS、碳酸酐酶(CA)。

PDH的活性与TAG的积累具有很强的相关性，并受丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)负调控，Ma等[1]通过RNA干扰敲低了微藻内的PDK基因(NsPDK)，使碳通量转向TAG积累，且改造后的基因工程藻细胞不受高光抑制。

ACCase抑制剂的存在会导致TAG累积水平显著下降，但研究发现过表达ACCase却不能提高微藻脂质积累，推测可能是受到了反馈抑制，其后续的研究不多[2-3]。

FAS催化脂肪酸碳链的加长，但目前尚未见到成功高表达FAS的报道。

2.2 增强Kennedy途径

相对于脂肪酸合成途径，Kennedy途径相对更靠近目标产物，因此更容易影响TAG的合成。与Kennedy途径相关的限速酶主要包括：GPAT、LPAAT、PAP、DGAT、G3PDH。

Niu等[6]在三角褐指藻中过表达GPAT基因，经尼罗红荧光染色发现其中性脂质含量增加了2倍，GC-MS分析显示不饱和脂肪酸比例与野生型相比显著提高，更有利于生产生物柴油。Balamurugan等[7]发现AGPAT1的过表达会促进富油新绿藻中参与TAG合成的其他关键基因如DGAT2和GPAT的表达，使TAG含量增加1.81倍，同时多不饱和脂肪酸中的EPA和DHA显著增加，而总碳水化合物和可溶性蛋白质含量低。

LPAAT是Kennedy途径的第二个酰基转移酶，Chungjatupornchai等[8]将莱茵衣藻的NeoLPAAT1稳定过表达至原始藻株的2倍，使TAG含量增加2.1～2.2倍，产率增加1.9～2.8倍。Wang等提出了一种结合遗传操作与间歇性热休克结合的新策略，将其它藻源的c-LPAAT和c-GPD1插入到莱茵衣藻的DNA中，3次热休克后c-LPAAT和c-GPD1的转录水平增加了5.3和8.6倍，脂质含量分别增加44.5%和67.5%。

PAP催化PA的去磷酸化，形成DAG和无机正磷酸盐，该反应在TAG的合成中是不可或缺的。Deng等[9]发现三角褐指藻中CrPAP2的mRNA水平比无氮培养条件时高，使用RNA干扰方法沉默CrPAP2基因后可导致脂质含量下降2.4%～17.4%，而过表达CrPAP2基因则导致脂质含量增加7.5%～21.8%，证明CRPAP2具有影响脂质合成的潜力。

DGAT是催化TAG生物合成最后步骤的关键酶。为了增加TAG含量，Klaitong等[10]在富油新绿藻中过表达NeoDGAT2，使其转录水平提高2倍，发现脂质积累加速，转化后TAG含量增加1.8～3.2倍，产率提高1.6～4.3倍。Niu[11]在三角褐指藻中过表达DGAT2后中性脂质含量增加了35%，多不饱和脂肪酸比例显著增加，且生长速率保持在较高水平，与Li等[12]的报告相似。

除了过表达单个或数个靶基因，Zou等[13]尝试在三角褐指藻中引入高效的组成型启动子Pt211来增加多个靶基因的表达水平。QPCR分析表明参与TAG生物合成的GUS、GPAT和DGAT2等基因在Pt211驱动下显示更高的转录丰度，并且不影响藻类的生长和光合作用。

2.3 抑制脂肪合成的竞争途径

淀粉合成途径会与Kennedy途径竞争共同前体G3P，抑制脂肪合成的竞争途径，改变碳分配方向，也能够提高微藻脂质积累水平。研究表明，莱茵衣藻的CONSTANS基因具有调节淀粉含量的作用，Deng等[14]敲低CONSTANS基因的表达，发现TAG生物合成相关基因(DGAT2、PAP2和PDAT3)的表达水平提高，使TAG含量增加24.5%。

微绿球藻是一种高产油的藻种，Ajjawi等[15]用RNA-seq分析在氮剥夺期间作为脂质合成负调节剂的多种转录因子，利用CRISPR-Cas9敲除真菌 Zn(II)2Cys6 编码基因的同源物，发现能够改善微藻在营养充足条件下总碳与脂质的分配，虽然突变体生长不良，但产生的脂质却是野生型的2倍。

3 总结与展望

微藻在非胁迫条件下进行碳捕获，合成和储存淀粉以支持生长和细胞分裂，只有在胁迫条件下倾向于以生长为代价积累大量的储存脂质，因此有必要对微藻TAG的生物合成途径和代谢调控进行深入的研究，在保持高生长速度的同时增加脂质积累，这对于生物柴油的生产是至关重要的。已有的研究成果表明，增强脂肪酸合成途径、增强Kennedy途径和抑制脂肪合成的竞争途径都能够影响TAG的合成。

与此同时，也要考虑基因工程微藻对生态系统的潜在风险，在将新型突变菌株作为工业用途之前，必需通过环境风险评估，防止具有优势的转基因微藻如果借助开放的水域中逃逸到外部环境，打破原有的生态平衡。

虽然基因工程手段增加微藻油脂积累的相关研究才刚刚起步，但鉴于其针对性强、效率高、潜在的经济效益突出，其科学意义和应用价值明显，成为越来越多的研究人员的关注焦点和研究热点，随着新发现和新成果的不断涌出，微藻产油的商业化应用必定会实现。