泛素羧基末端水解酶-1在神经退行性疾病中的作用及临床应用

杨 依 赵 丽

神经退行性疾病是由神经元和(或)髓鞘的丧失所致，病情随着时间的推移而恶化，最终出现功能性障碍。常见的神经退行性疾病有：阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)等。目前这些疾病的发病机制尚不清楚，主要有兴奋毒性学说、细胞凋亡学说、氧化应激学说等，这些学说均与泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)密切相关。泛素羧基末端水解酶1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1，UCH-L1)作为UPS中的重要组成蛋白，在神经退行性疾病的发生、发展中发挥重要的作用。

一、UCH-L1与UPS

UPS是真核细胞内蛋白降解的重要途径，泛素(Ub)是UPS核心，是由76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白。UPS有两类重要的酶：泛素化酶和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUB)，UCH是去泛素化酶中的一个重要家族。UCH有3种异构体：UCH-L1、UCH-L2、UCH-L3。UCH-L1主要分布在大脑神经元中，可以达到脑内总蛋白量的2%。用组织原位杂交的方法发现其多分布在黑质致密部，或者存在于周围神经系统如三叉神经节等处。此外，UCH-L1也存在于卵母细胞及精母细胞。

UCH-L1主要有3种功能：①水解多聚泛素链，使泛素单体可以重复使用；②以二聚体形式作为一种不依赖ATP的泛素连接酶催化k-63形式泛素链的形成，从而竞争性抑制k-48形式泛素链与异常蛋白的结合，使异常蛋白不能被蛋白酶体识别、降解；③稳定泛素分子单体，并可以通过调节泛素单体水平起到对UPS的调控。

二、UCH-L1与阿尔兹海默病

阿尔兹海默病(AD)是一种中枢神经系统变性病，为老年期痴呆最常见的一种类型，表现为进行性认知功能障碍和行为损害。临床及组织病理学研究表明，AD主要有两个病理特征：因病理性β淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)沉积而生成的老年斑；因微管相关蛋白tau蛋白过度磷酸化而形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。UCH-L1已被证明在突触可塑性、学习记忆的调节中发挥重要作用，与AD的发生密切相关[1]。

1.UCH-L1参与AD的可能发病机制：相关研究通过质谱分析的方法发现AD患者脑中可溶性UCH-L1与颗粒性UCH-L1的比例发生明显改变[2]。可溶性UCH-L1是功能的主要执行者，它的改变可能参与AD发病。与野生型小鼠比较，作为AD模型的APP/PS1双转基因小鼠海马区可溶性UCH-L1含量下降约30%，且海马区长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)受到抑制，出现认知障碍；而转染UCH-L1后的小鼠能够恢复UCH-L1活性且LTP恢复到正常水平[3]。

(1)UCH-L1与Aβ：UCH-L1可影响Aβ含量和神经元的活动。缺血性脑损伤处理后的小鼠脑中UCH-L1含量与活性均会降低，导致BACE1水平上调，BACE1作为β分泌酶可以促进APP向Aβ方向的分解，从而导致Aβ聚集。而小鼠经过注射外源UCH-L1蛋白后大脑中BACE1含量下降，神经元的存活率得到提高[4]。同时，小鼠原代神经元经此处理后由Aβ引起的脑源性神经营养因子(BDNF)逆向运输减少的现象得到明显改善，使神经元的生存率和可塑性得到提高[5]。

(2)UCH-L1与NFTs：研究发现敲除UCH-L1基因的小鼠出现类似AD症状。该小鼠脑中可溶性UCH-L1含量下降，而脑神经元中神经元纤维缠结(NFTs)数量增多，提示UCH-L1可能参与神经原纤维缠结的形成[6]。具体体现为：一方面，UCH-L1的下调可促进tau蛋白高磷酸化而形成NFTs。LDN是UCH-L1抑制剂，经LDN处理后的小鼠N2a细胞中微管结合tau蛋白含量下降，说明UCH-L1影响tau蛋白的微管结合能力，而未与微管结合的tau蛋白容易聚集。利用高磷酸化tau(Ser202、Thr205)特异性抗体AT8进行免疫荧光与硫黄素染色发现tau蛋白高磷酸化并异常聚集，且都以LDN剂量依赖性增加[7]。另一方面，UCH-L1的下调还可减少异常聚集tau蛋白的降解。在tau相关神经系统疾病中，UPS由于超出其所能承受的负荷或功能受损而无法有效降解蛋白质。此时组蛋白去乙酰化酶(HDAC6)可与泛素化蛋白形成复合物，运输到微管组织中心形成聚集体，减小异常聚集蛋白对细胞产生毒性作用的范围，并通过自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)将其降解。转染tau441后的HEK293细胞可过量表达tau蛋白，此后，与单独应用蛋白酶体抑制剂MG132比较，同时应用MG132和LDN处理的细胞中HDAC6与tau蛋白的结合下降，不能形成标志性的核周球状聚集体结构，而此时UCH-L1寡聚体水平显著降低，k-63形式的泛素链水平降低。表明在tau蛋白过量表达、异常聚集的情况下，UCH-L1寡聚体的下调会减少k-63形式泛素链的产生，抑制HDAC6的激活，从而影响HDAC6与tau蛋白的结合，使得小分子泛素化的tau蛋白在细胞质中分散，影响聚集体的形成，阻止异常聚集的蛋白质经自噬-溶酶体途径降解[8]。

2.UCH-L1多态性对AD的保护：UCH-L1多态性对AD的保护作用一直存在争议。UCH-L1基因的3号外显子上第54位胞嘧啶突变为腺嘌呤(C54A)可使得相应位点出现S18Y多态性。2006年，Xue等对中国汉族散发AD患者和健康人的基因分析结果表明A等位基因和AA基因型可能对女性散发AD有保护作用。然而，2010年Zetterberg等对瑞典AD患者和健康人群的调查统计则发现S18Y多态性未对AD产生保护机制。此外，有研究通过Meta分析发现，UCH-L1基因的5种常见的单核苷酸多态性(SNPs)，即rs11556271、rs3756002、rs3775256、rs4861387、rs28581187与日本AD患者发病无相关性，不能作为评估AD发病的风险因素[9]。

三、UCH-L1与帕金森病

帕金森病(PD)是仅次于阿尔兹海默病的第2大神经退行性疾病，PD可分为家族性PD(FPD)和散发型PD(SPD)。中脑黑质多巴胺神经元的变性以及细胞蛋白内含物——路易小体的出现是帕金森症的两个病理学标志，α-突触核蛋白是路易小体的重要组成成分。特异性敲除其多巴胺神经元UCH-L1基因后的黑腹果蝇出现神经退行性改变，导致其脑内多巴胺含量下降，从而出现运动功能障碍[10]。UCH-L1对PD的作用主要通过引发UPS异常而实现，而某些突变型UCH-L1的致病作用还与自噬-溶酶体途径有关。

1.UCH-L1调节α-突触核蛋白的细胞间传递：尽管诸如α-突触核蛋白等蛋白质包涵体在细胞间传递的详细机制尚未得到充分了解，但预计这种传递可以解释许多神经退行性疾病的发病机制[11]。近年来，脂筏(lipid raft)被认为可通过影响神经元中特异性细胞内含物的转运、传播从而与神经退行性疾病的发生、发展密切相关。研究发现，UCH-L1与脂筏功能密切相关：在UCH-L1含量下降的原代神经元中，脂筏依赖性内吞作用增强，内源性α-突触核蛋白的含量没有明显变化但其在细胞间的传递显著增加。考虑到UCH-L1的去泛素化作用及其与脂筏的联系，UCH-L1可能是通过调节脂筏蛋白的泛素化和去泛素化状态而调节脂筏依赖性的内吞作用[12]。

2.UCH-L1突变与PD

(1)UCH-L1I93M突变与PD:1998年Leroy等在德国一个PD家系中发现UCH-L1基因突变(C277G)，这一突变导致UCH-L1编码的第93位异亮氨酸(I)变为甲硫氨酸(M)，水解酶活性降低约50%。2004年Ardley等研究发现，相比于对照组，转染UCH-L1I93M突变质粒后的COS-7细胞中呈聚集状态的内含物含量更高。UCH-L1I93M产生的毒性作用可能参与PD的发病。与野生型小鼠比较，转染UCH-L1I93M基因的gad小鼠在行为学上表现出自发活动的减少，而在神经病理学改变上表现出黑质多巴胺神经元减少，一部分黑质神经元中出现致密核心小泡和嗜银颗粒，这些表现都与PD症状极为相似。免疫印迹显示中脑不溶性UCH-L1比率大大提高，提示I93M突变引发的毒性作用可能导致了多巴胺神经元的退行性改变，从而参与了PD的发病[13]。UCH-L1I93M活性的下降也是引发PD重要因素。DUB活性下降的UCH-L1I93M可通过影响自噬-溶酶体途径而抑制α-突触核蛋白的降解。用mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系追踪HeLa细胞系的LC3水平和自噬流发现UCH-L1I93M突变细胞中GFP/RFP比率没有明显改变，但LC3斑点轻微增加且细胞中p62含量明显积累，表明自噬体和溶酶体的融合过程未受影响，但自噬体的形成受到一定程度的抑制，自噬功能出现严重障碍。此时，α-突触核蛋白以及异常蛋白的清除必然受到影响，过多的有毒产物聚集形成路易小体，导致PD的发病[14]。

(2)UCH-L1S18Y多态性与PD：S18Y多态性被发现在PD中起到神经保护作用：UCH-L1S18Y基因所转录的UCH-L1蛋白二聚化趋势降低，具有水解酶活性高而连接酶活性低的特点。此时底物α-突触核蛋白更容易被蛋白酶体识别，经UPS降解而减少PD的发病[15]。S18Y多态性的保护作用在小鼠身上已经得到证明。经腺病毒转染UCH-L1S18Y基因的小鼠可明显减少因MPTP诱导引起的黑质神经元损失，同时纹状体多巴胺含量的下降幅度也降低[16]。然而，S18Y多态性对于人类的保护作用却一直受到质疑。Liu等[17]将22项遍及各大洲的研究进行Meta分析后发现，UCH-L1多态性与人群患PD风险中度相关；而对亚洲、欧洲和美国人群UCH-L1多态性进行的亚组分析未显示任何与PD风险有关的种族依赖性；对年龄进行亚组分析时，仍未观察到明显关联；但剔除其中3项低质量研究后的Meta分析显示,UCH-L1等位基因A与PD风险显著相关；同时，在隐性模型(CC vs CA+AA)中也显示出S18Y多态性与PD风险密切相关[17]。

四、脑脊液UCH-L1水平对于神经退行性病变的诊断

近期的研究发现，脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中UCH-L1水平对于PD、AD的诊断起重要作用。与正常人群比较，AD患者CSF中UCH-L1水平明显升高。因此，CSF中UCH-L1可作为AD的诊断依据和分子标志物[18]。相反，与正常人群比较，PD患者CSF中UCH-L1含量明显下降，也可用于PD的诊断。此外，研究发现PD患者CSF中UCH-L1浓度与发病年龄亦呈正相关，且用于突触核蛋白病(包括PD和MSA)患者病情程度分级的Hoehn and Yahr(H&Y)量表得分与CSF中UCH-L1水平呈正相关，提示CSF中UCH-L1水平可能作为突触核蛋白病的阶段分层指标[19]。

五、展 望

近年来临床研究发现，脑脊液中UCH-L1水平在AD、PD患者与健康人群中存在显著差异，UCH-L1有望对临床确诊、疾病程度分级工作起到辅助诊断作用。然而尽管已有众多研究探讨了UCH-L1的结构和功能，发现UCH-L1对神经退行性疾病有着重要的作用，但是UCH-L1在AD、PD发生、发展中的作用机制尚不清楚。

UCH-L1对神经退行性疾病中的特殊内含物或标志物都有重要影响，其中可溶性UCH-L1的作用尤为重要。脂筏模型是近年来神经退行性疾病中的讨论热点，UCH-L1被发现可以通过脂筏蛋白调节α-突触核蛋白的细胞间传递，且与目前一些已知蛋白对于脂筏的影响机制明显不同，但这一具体作用机制还未被发现。关于UCH-L1S18Y多态性、UCH-L1I93M突变对神经退行性疾病的保护或促进作用仍然存在分歧，不同的研究调查显示出不同的结果，因此还需要更多数据统计来源和人群分类方法以得出最终结论。

综上所述，鉴于UCH-L1对于神经退行性疾病的重要影响，进一步深入研究UCH-L1在神经系统中的功能和作用底物对明确神经退行性疾病的发病机制有十分重要的指导意义，同时也可为神经退行性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗以及新药的开发提供新的思路和靶点。同时也应当认识到，不仅要探讨UCH-L1的下游通路以发现其在神经退行性疾病中的作用，更要追根溯源，探索导致UCH-L1发生改变的原因，如导致UCH-L1不同形式之间转换以及导致UCH-L1发生不同翻译后修饰的影响因素，从根本上降低神经退行性疾病的发生概率。