轴突起始段与神经系统疾病研究

宋彬彬 杨 璇 甄 然 于 佳

神经元是神经系统最基本的结构和单位，高度极化，由胞体和较长的突起(轴突和树突)构成。哺乳动物中枢神经系统神经元中在胞体-树突区(somatodendritic domain)和轴突之间存在神经元动作电位启始的特定部位，称为轴突起始段(AIS)。AIS对于维持神经元极性和功能，建立完整的神经元回路非常重要[1]。本文主要对轴突起始段的结构、功能、可塑性及其相关神经系统疾病进行综述。

一、轴突起始段的结构

AIS是起始于近胞体的轴丘(axon hillock)至髓鞘开始包绕为止的无髓鞘结构，长度为20～60μm，直径为0.5～2.0μm。电镜观察到大鼠海马CA3神经元AIS纵切面具有膜下致密层和微管束，且核糖体数量急剧下降。膜下致密层可分为3层，即7.5nm厚连接质膜的颗粒层、7.5nm厚中间层和35nm厚下层。微管束由5～8根微管形成，3～10根微管束易聚集，聚集的微管束间距约为40nm，且被蛋白质连接。横切面观察AIS可分为质膜、亚质膜和内部3部分，由支架蛋白(scaffolding protein)——ankyrin G(Ank G)连接。AIS质膜特异性富集多种离子通道和细胞黏附因子(cellular adhesion molecules，CAMs)等跨膜蛋白；亚膜区具有肌动蛋白(actin)和βⅣ血影蛋白(βⅣ spectrin)等重要的细胞骨架蛋白；内部主要分布神经纤维、微管束和肌动蛋白丝(actin filaments)[2]。肌动蛋白丝可形成环状结构，沿轴突中心均匀分布，间隔为180～190nm，支撑细胞骨架。AIS特殊组成和结构对于其维持神经元结构和起始动作电位具有重要作用[3]。

Ank G是AIS中富集的早期定位蛋白，对于招募AIS相关蛋白和微管成束有重要作用。ankyrins N端具有Ank重复序列的膜结合域(membrane binding domain，MBD)，中间具有ZU5结构域、UPA结构域、神经元外显子区域和“死亡域”(death domain，DD domain)，C端具有调节结构域。MBD可直接与钠离子通道、钾离子通道、神经束蛋白186(neurofascin-186，NF-186)和神经细胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule，NrCAM)结合[4]。ZU5结构域可与βⅣ spectrin结合。Ank G与不同蛋白质相互作用机制不同，磷酸化的钠钾离子通道与Ank G的亲和力增加，而细胞黏附因子NrCAM和NF186通过FIGQY基序与Ank G结合，FIGQY基序中酪氨酸磷酸化会减弱其与Ank G的结合。Ank G S2417A突变使βⅣ spectrin在AIS定位明显减少，但不会影响Ank G和NF186在AIS 聚集。而Ank G DAR999AAA突变虽可破坏Ank G ZU5结构域与βⅣ spectrin结合能力，但对βⅣ spectrin在轴突近端的聚集无显著影响[5]。AIS中存在两种肌动蛋白丝类型：短而稳定的肌动蛋白丝和长而不稳定的肌动蛋白丝。AIS中环状结构主要由短而稳定的肌动蛋白丝末端被内收蛋白(adducin)加帽形成，通过βⅣ spectrin与NF186-Ank G-Nav复合物相连，主要作用于AIS选择性屏障的形成。而长而不稳定的肌动蛋白丝可促进AIS膜下致密层重组[6]。Ank G也可通过微管正端示踪蛋白EB1和EB3与微管相连，稳定微管晶格，促进微管成束[7]。AIS中微管成束是神经元极化的早期特征。微管束在AIS形成过程中可以捕获AIS结构组分，并且选择性透过胞质蛋白，对于AIS的结构和功能具有重要作用[8]。

二、AIS的功能

1.维持神经元极性：AIS对于维持轴突完整性和神经元极性具有重要作用[3]。研究发现，体外培养10天的海马神经元轴突远端(≥35μm)横切后诱导轴突再生，不影响神经元极性。而轴突近端(<35μm)横切后受损轴突中轴突标志物tau-1阴性，而树突末端延长，且tau-1阳性，树突标志物MAP2阴性，提示树突转变为轴突样结构。这说明AIS是维持成熟神经元极性的重要部位[9]。AIS中Ank G 、βⅣ-spectrin和actin等形成特殊的细胞骨架可作为选择性屏障，特异性允许轴突蛋白和脂质等通过，而屏蔽胞体和树突内物质的进入。Petersen等[10]研究发现，体外培养的大鼠海马神经元中，树突囊泡可从胞体向轴突中运输3～10μm，在AIS近侧突然停止后返回胞体或与质膜融合，而轴突囊泡可匀速通过AIS进入轴突。药物处理神经元使actin细胞骨架解聚可破坏AIS和蛋白质分选，使树突囊泡进入轴突，且长距离顺向运输。另有研究发现，AIS中Ank G可招募动力蛋白(dynein)活性调节因子Lis1(lissencephaly 1)和NDEL1(nuclear distribution protein nudE-like 1)，从而激活dynein将胞体-树突货物从AIS逆行运输回胞体[11]。

2.动作电位起始：AIS中聚集大量的钠离子(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.6)、钾离子Kv1(Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4)、Kv2(Kv2.1、Kv2.2)、Kv7 (Kv7.2/KCNQ2、Kv7.3/KCNQ3)电压门控通道，是调节神经元动作电位起始的重要结构。钠离子通道中Nav1.6具有最低激活阈值，对动作电位起始具有主要作用。而Kv1 和Kv7可抵消钠离子通道，抑制动作电位起始。Kv2被动作电位激活后可加速动作电位复极化，促进重复放电。AIS中也存在钙离子电压门控通道(Cav2.1、Cav2.2、Cav2.3、Cav3)，Cav2.3、Cav3可促进动作电位起始，而Cav2.1、Cav2.2抑制动作电位产生[12]。且AIS中离子通道组成具有细胞类型特异性和AIS分布特异性，钠、钾、钙离子通道需协同调控动作电位的产生和传播。另有研究发现，皮质和海马神经元AIS远端富集GABAA-α2受体，在细胞黏附因子NF186作用下可特异性与γ-氨基丁酸能(GABAergic) 中间神经元形成轴突-轴突突触，负调控动作电位起始[13]。

三、 AIS结构和功能的可塑性及其调节

1.AIS具有结构和功能可塑性：神经元静息状态时AIS为相对静态结构，AIS也可根据神经元活性变化调节AIS长度、定位和蛋白的表达，具有可塑性。研究发现，使用 KCl处理体外培养10～12天的海马兴奋性神经元3～48h后，使AIS向轴突远端明显移动，AIS长度下降25%，AIS中钠离子通道蛋白和neurofascin等定位减少，且神经元兴奋性下降，这说明AIS具有结构和功能可塑性[14]。且AIS长度和定位对神经元放电和兴奋性具有特异性调节，当AIS距胞体较近时，AIS长度增加可提高轴突中钠钾离子电流传导，增强神经元兴奋性。而当AIS距胞体较远时，AIS增长，神经元兴奋性下降，这是由于随着距离增加电荷损耗增大，AIS去极化受到抑制引起的[15]。AIS可塑性具有细胞类型依赖性：(1)15mmol/L KCl分别处理海马CA1、CA3区神经元3h，只有CA3神经元中AIS长度明显下降，且GABA+神经元AIS缩短不明显[14]。(2)10mmol/L KCl处理体外培养11天的大鼠嗅球(olfactory bulb，OB)多巴胺能神经元24h后，AIS向胞体移动，且长度增加，这与兴奋性神经元不同。当培养基中10mmol/L KCl更换为10mmol/L NaCl，5天后AIS可恢复到初始位置和长度[16]。

2.AIS可塑性调节：(1)磷酸酶和磷酸激酶调节：研究发现，海马神经元中AIS移位依赖于L型钙离子通道(L-type VGCCs)激活后钙离子进入神经元，使钙调磷酸酶(calcineurin)活化来触发。药物FK506处理海马齿状回颗粒细胞(dentate granule cell，DGC)抑制钙调磷酸酶(calcineurin)的活性，可消除去极化引起的AIS位移[17]。而FK-506不能阻止多巴胺能神经元中去极化引起的AIS长度变化[16]。细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)广泛参与调节神经元中AIS可塑性。使用药物Roscovitine单独处理DGC 6h，抑制CDK5活性，AIS可明显缩短，且AIS长度与处理时间呈负相关[14]。Roscovitine处理多巴胺能神经元24h，可使AIS不依赖于KCl去极化向胞体移动，且AIS明显缩短[16]。(2)肌球蛋白调节：肌球蛋白(myosin)是沿着肌动蛋白丝运动的分子马达家族。Evans等[18]研究发现，肌球蛋白myosin Ⅱ参与调控活性依赖的AIS可塑性。体外培养10天的大鼠海马神经元中，myosin Ⅱ活性抑制剂blebbistatin可完全抑制KCl去极化引起的AIS位移和缩短。进一步研究发现AIS中富集磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain，pMLC)，pMLC可激活myosin Ⅱ的收缩活性，且与Ank G 共定位，可促进Ank G在AIS定位和AIS组装。KCl诱导大鼠海马神经元去极化5min，AIS中pMLC水平下降61%，30min时pMLC下降83%，Ank G下降35%，60min时Ank G和Nav蛋白表达水平下降约40%，这提示去极化时pMLC水平与AIS相关蛋白含量变化有关。随机光学重建显微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)检测发现AIS中pMLC与肌动蛋白环(actin rings)共定位。actin稳定试剂可以完全抑制去极化引起的Ank G下降，缓解pMLC在AIS的减少，这提示actin异常是AIS分解的晚期事件。神经元去极化时pMLC水平下降使myosin Ⅱ收缩活性降低，引起actin不稳定，参与调节AIS结构可塑性[19]。(3)细胞分泌物调节：Guo等[20]研究指出神经元密度差异可能通过细胞分泌物的含量变化来调节AIS可塑性。体外实验证实大鼠海马神经元密度越小，AIS距胞体的距离越长，神经元兴奋性降低。进一步研究发现脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和神经营养素(neurotrophin 3，NT3)可通过激活酪氨酸激酶受体TrkB(tyrosine kinase receptor B)和TrkC(tyrosine kinase receptor C)参与调节AIS移动，而神经生长因子不具有此功能。

四、AIS异常与神经系统疾病

AIS是维持神经元极性和功能的重要结构，多种神经系统疾病中AIS发生异常改变，而AIS相关蛋白突变或可塑性受损也可引起癫痫、脑卒中、认知功能障碍和运动神经元病等多种神经系统相关疾病。

1．癫痫：癫痫(epileptic)是由多种原因引起的一种慢性脑功能障碍疾病。离子通道结构和功能改变对癫痫的发生有密切作用。Nav1.6(由SCN8A编码)高度富集于哺乳动物中枢神经系统神经元的AIS。Nav1.6 参与调控动作电位起始，也可通过调节持续钠电流影响神经元兴奋性。 Nav1.6由6个跨膜结构域和胞质N端、C端结构域组成，Nav1.6致病突变(Arg1617 和Arg1872)主要位于其C端，可使钠离子通道失活受损，神经元过度兴奋，引起早期婴儿型癫痫性脑病[21]。Nav1.6 发挥正常功能与其定位相关，Nav1.6 N端可与微管结合蛋白MAP1B相结合，而N端突变可使二者结合受损，导致Nav1.6在AIS定位减少，使持续性钠电流异常增大，从而与疾病相关[22]。

2.脑卒中：研究发现，脑卒中引起缺血性坏死中心神经元中AIS细胞骨架蛋白发生快速、不可逆的钙蛋白酶(calpain)依赖性水解[23]。缺血性脑损伤小鼠模型大脑中动脉闭塞6h后，皮质神经元发生明显的钙离子依赖性钙蛋白酶calpain激活，引起AIS中βⅣ spectrin、Ank G 和Nav特异性水解。体外培养的海马神经元糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation )2h后，AIS中βⅣ spectrin 染色强度显著下降，且可持续8～10天，使AIS组成发生不可逆损伤，破坏神经元极性[24]。

3.阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)：DNA甲基化异常与AD发生相关。Sanchez-Mut等[25]利用AD患者尸检皮质样本和小鼠模型研究发现Spnb4(spectrin beta 4)基因高度甲基化。而Spnb4基因编码的SPTBN4蛋白可与Ank G结合，SPTBN4突变或异常可能通过与Ank G结合受损而抑制动作电位起始，改变神经元兴奋性。而且AD神经元中AIS完整可维持tau在轴突定位，负调控tau错位积聚。Sun等[26]研究发现，与野生型小鼠比较，AD小鼠海马组织中neurofascin蛋白水平下降50%，海马神经元中Nav 1.6分布于整个轴突，且AIS中水平下降。野生型小鼠海马神经元中只有小分子蛋白(10kDa和27kDa)可进入轴突，而大分子蛋白(90kDa)不能进入轴突。而AD小鼠模型中，大分子和小分子均可进入轴突，提示AIS胞质屏障功能受损。Ank G缺失纯合小鼠表现出明显运动缺陷和认知功能障碍[5]。

4.额颞痴呆(frontotemporal dementia，FTD)：微管结合蛋白tau参与维持AIS结构和功能。tau异常可破坏AIS中Ank G和微管的稳定性，改变AIS定位。tau蛋白病-FTD与神经网络异常兴奋有关，而AIS结构和可塑性对于调控神经元兴奋性至关重要。最新研究发现，FTD患者多能干细胞衍生的神经元中， FTD致病突变tau V337M 通过使EB3在AIS异常积累，EB3与Ank G共定位增加，从而破坏AIS可塑性，使神经元异常兴奋。

5.运动神经元病：早期研究发现，肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者和小鼠模型脊髓前角神经元AIS中滑面内质网、线粒体、溶酶体、神经纤维等积累，轴突运输障碍，AIS肿胀，直径明显增加，且这种变化出现于运动神经元病早期。

6.其他：全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)研究发现Ank G编码基因ANK3是双相情感障碍(bipolar disorder，BP)高风险因子。精神分裂症(schizophrenia)患者脑组织尸检发现皮质表层椎体神经元AIS中Ank G表达下降15%～20%，AIS长度无明显变化。多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)患者血清样本中NF186含量明显增加。2型糖尿病小鼠模型前叶皮质和海马神经元中AIS显著缩短。皮质兴奋性神经元AIS可与皮质小胶质细胞相连，而当脑损伤小胶质细胞被激活后，与小胶质细胞相连的AIS数量减少。

五、展 望

综上所述，AIS是富集Ank G、βⅣ spectrin、细胞黏附因子和离子电压门控通道等多种组分的特殊轴突起始部位，具有维持神经元极性和动作电位起始功能。AIS具有结构和功能可塑性，且AIS可塑性受到磷酸酶和磷酸激酶、肌球蛋白、细胞分泌物等调节。在多种神经系统疾病中，AIS组成蛋白或结构明显发生异常改变，这与神经元活性受损紧密相关，故AIS可能作为疾病防治的重要靶标。但AIS组成和病理变化复杂，具有细胞类型依赖性，且多种蛋白质间通过不同机制相互作用共同调控疾病进程。因此AIS在生理、病理条件下的可塑性变化和机制，及其与疾病的关系亟需深入研究。