副鸡嗜血杆菌病的诊断要点

周子涛

辽宁省锦州市农业农村综合服务中心，辽宁锦州121004

1 涂片镜检

无菌采集病鸡鼻腔、眶下窦分泌物并抹片，依次做革兰染色、瑞氏染色，通过显微镜放大观察，能够发现有革兰氏阴性短杆菌的存在，这些细菌一般是单个排列、散乱排列或者是成对排列，其间还存有卵圆形球状菌体，但是并没有任何荚膜和芽孢，用美蓝染色时表现为两极浓染[1]。

2 细菌分离培养

操作过程必须做到无菌，把蘸取分泌物的棉拭子直接在鲜血琼脂培养基上进行划线接种，通过烛缸置于37 ℃的条件下培养2 d。通过试验可以观察到该菌落外部呈现灰白色状态，且并不粗糙，略微显得凸起且并不完全透明，该菌落的半径为0.25～0.50 mm，不与血清相溶，于普通的液体琼脂培养基上基本不会生长。因此，该菌对糖类等生化反应的程度并不强[2]。

3 血清学试验

3.1 平板凝集试验

抽取患病鸡群的血液进行分离处理，获得血清，分别抽取0.05 mL 的A、B、C 3 种血清型的标准抗原滴在试验用的干净平板上，然后滴加等量的样品血清，设置试验空白对照组以及阴性和阳性对照组。加入样品时，应该充分搅匀，确保二者能够完全结合发生反应，静止3～5 min 后观察凝集结果，没有出现凝集的就可以判定为阴性，反之，则判定为阳性。

3.2 血凝抑制试验（鉴定血清型）

培养菌落从而制备抗原，按规定方法进行血凝抑制试验，能使红细胞完全凝集抑制的血清最高稀释度即为该型血清的HI 效价。如果被检抗原与一个以上型的阳性血清有凝集抑制，其与某型阳性血清的HI 效价最高，即判定该抗原为该血清型。

3.3 血凝抑制试验（检测副鸡嗜血杆菌抗体）

稀释待检血清，室温下作用4 h 或4 ℃低温过夜，中间充分振荡，然后离心，取上清。用NaCl 溶液对洁净的血凝板中第2 个孔位进行稀释，将每个孔内的样品和对照品按照高倍向低倍度进行稀释，试验设计的稀释浓度为2～5 倍。血清孔中加入稀释好的抗原，充分振荡，于室温下作用20～30 min 或者37 ℃静置20 min。每孔加入1%醛化红细胞，充分振荡，于室温下作用40～60 min 或者37 ℃静置40 min。

4 动物接种试验

选取5 只动物样品，将细菌注入样品的眼痘中，经过2 d 后观察动物出现的炎症反应，一般会出现鼻炎的病症。

5 药敏试验

从病鸡中提取到细菌，并将其转接到培养基上，分别采用磺胺嘧啶、磺胺米隆以及新诺明等磺胺类药物和氟苯尼考、罗红霉素、土霉素、新霉素等广谱抗菌药物试纸片进行测试，最后通过观察试验结果，选定发生敏感反应的特效治疗药物[3]。

6 间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）

将抗原用包被液稀释至工作浓度，加入酶标板各孔中，置4 ℃冰箱过夜。洗板，加入稀释血清，设置阴性、阳性对照组及空白对照组，37 ℃温箱中作用30 min。洗板，加入酶标抗体，37 ℃温箱中作用30 min。洗板，加入底物液，室温避光反应10～15 min，加入终止液，放入酶标仪读数。

7 聚合酶链式反应（PCR）技术

无菌蘸取病鸡眶下窦中黏液或者浆液，浸入生理盐水，室温放置0.5 h 后用棉拭子将管壁上的液体尽量挤干，然后丢弃至消毒液缸内。离心，弃去大部分上清液，加入灭菌去离子水，煮沸再冰浴后再次离心，取出上清作为PCR 样品。经过3 个阶段的PCR 扩增，用1%琼脂糖胶检测扩增产物。