肉鸡H9亚型禽流感继发细菌感染的诊断

李 晔 康佳楠 郭文洁

沈阳工学院，沈阳113122

1 病理剖检

死淘肉仔鸡20 多日龄，个体大小及重量差异较大，死淘鸡肛门处羽毛污秽黄染。剖检病死鸡气囊增厚，表面有纤维素渗出物，有心包炎和肝周炎，喉头、气管黏液增多，泄殖腔黏膜有出血条带，有部分病死鸡肺脏淤血，有灰白色坏死灶。

2 实验室检测

2.1 样品采集与运送

无菌采集10 只死淘鸡喉气管、心、肺、肝、脾、肾和泄殖腔等组织，每份组织样品单独盛放，每只鸡采集的所有组织样品形成一个包装和编号，包装好的样品4 h 内冷藏运输到兽医实验室。

2.2 细菌学检验

心、肝、脾、肺等实质脏器涂片，革兰氏染色镜检均发现G-杆菌，将麦康凯琼脂和TSA 琼脂用直径15 mm 的平皿制成3 mm 厚的平板，分成心、肝、脾、肺4 个区。烧烙心、肝、脾、肺组织的表面，用灭菌剪剪开，心脏要剪至露出心内膜，用接种环勺取少量各种组织，按组织类别分别在麦康凯琼脂和TSA 琼脂平板上分好的区内划线，接种好的培养基置于生化培养箱中37 ℃培养24 h，结果9 份实质脏器样品在麦康凯琼脂培养基上分离到了粉红色不透明、圆整、隆起的中等大小菌落，采用肠杆菌科微量生化管鉴定为大肠埃希氏菌；2 份肺脏样品在TSA 琼脂上分离到圆形、湿润、大而扁平的菌落，细菌产绿色素，48 h 后整个培养基变成暗绿色，用非发酵菌微量生化管鉴定为铜绿假单胞菌。分离到的大肠埃希氏菌与铜绿假单胞菌纯化菌株如图1、图2所示。

图1 大肠埃希氏菌在麦康凯培养基上的粉红色菌落

图2 铜绿假单胞菌在TSA 琼脂上产绿色素

2.3 分子生物学检验

核酸提取与纯化试剂、H9AIV 核酸检测试剂（RT-PCR 荧光探针法）均为中山大学达安基因股份有限公司提供。将喉气管和泄殖腔组织剪碎、研磨，按1∶5 加入PBS 制成匀浆，将匀浆转入离心管中3 000 r/min 离心10 min，取上清液转入Eppendoff管中准备进行病毒核酸提取和检测。Total RNA 提取采用离心柱法：取组织匀浆上清液100 μL，加入裂解液600 μL，充分颠倒混匀，室温静置5 min，将液体转移至吸附柱中（吸附柱要套上收集管），13 000 r/min 离心30 s，弃去收集管中液体，加入600 μL 洗液，13 000 r/min 离心30 s，如此重复洗涤1 次，洗涤完成后离心去除残留的洗涤液。将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液50 μL，室温静置1 min，13 000 r/min 离心30 s，则离心管中收集的液体为洗脱的RNA 溶液。H9AIV核酸检测采用荧光RT-PCR 方法，一步法RT-PCR反应条件为：50 ℃ 15 min，1 个循环；95 ℃ 15 min，1 个循环；94 ℃15 s，58 ℃45 s（在该点收集荧光，荧光探针检测模式为FAM），40 个循环。结果判定：检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct值＞37，判为H9AIV 阴性；检测样品Ct值≤37，扩增曲线有明显的对数增长期，判为H9AIV 阳性。经检测有7 份样品H9AIV 核酸阳性，H9AIV 核酸扩增曲线见图3。

图3 H9AIV 核酸荧光RT-PCR 曲线

3 小 结

本肉鸡群死淘率偏高、投喂抗生素时好时坏的根本原因是存在H9AIV 感染，导致细菌病继发不断。本病例同时分离到了大肠杆菌和铜绿假单胞菌，均为条件致病菌。单独感染H9AIV 的鸡群通常发病率高，但一般呈温和经过，H9AIV 往往在其他病原的协同作用下造成禽类大批死亡和产蛋严重下降。一般种鸡通过接种H9AIV 灭活疫苗预防该病，所产的商品鸡可获得较高水平的母源抗体，10日龄前获得保护，商品蛋鸡可在10日龄、40日龄、23 周龄进行3 次H9 亚型禽流感（H9AI）免疫，使蛋鸡在育雏、育成、产蛋期都保持良好的抗体水平。但是白羽商品肉鸡由于饲养周期短、饲养量大、鸡肉品质要求等原因无法进行H9AI 免疫，一旦感染H9AIV 会导致鸡群免疫力低下、呼吸系统屏障损伤，进而细菌病多发。投喂抗生素不能从根本上解决问题，还会导致鸡肉制品抗生素残留以及耐药菌株的产生，因此白羽肉仔鸡场对H9AIV 关键是“防”，尤其是肉仔鸡11日龄后，母源抗体趋于消失时要密切落实隔离消毒工作，在H9AI 易发的冬春季节加强饲养管理，禽舍温度要保持在18～22 ℃，湿度50%～60%，可在禽舍有代表性的位置悬挂温湿度表，同时要合理通风换气，保持空气清洁无氨味，避免肉仔鸡呼吸道屏障受损，为病毒侵入打开门户。此外，鸡新城疫和鸡传染性支气管炎感染的临床症状易与H9AI 相混淆，而且易与H9AI 发生混合感染，因此要做好鸡新城疫和鸡传染性支气管炎的联合预防，最好采用HA/HI 试验和ELISA 试验对肉鸡养殖场的禽群开展抗体检测，根据检测结果制定和调整免疫程序。