人体肠道细菌的培养组学研究进展

牛尚博, 蔡嘉裕, 韦金涛, 黄嘉伟, 方舒婷, 吴继国, 张国霞,*

人体肠道细菌的培养组学研究进展

牛尚博1, 2, 蔡嘉裕2, 韦金涛2, 黄嘉伟2, 方舒婷2, 吴继国2, 张国霞2,*

1. 南方医科大学第一临床医学院, 广州 510080 2. 南方医科大学公共卫生学院环境卫生学系, 广东省热带病研究重点实验室, 广州 510080

人体微生物组学研究显示肠道细菌与健康关系极为密切。人体肠道丰富多样的细菌构成了肠道细菌组, 是人体微生物组数量最多的部分。研究肠道细菌时使用较多的是宏基因组学方法, 但技术本身存在“深度偏差”等缺点亟待解决。肠道细菌的培养组学是近年来的一个研究热点, 该方法可以在一定程度上减小宏基因组学带来的误差, 培养条件的多样化亦可帮助研究者找到目标菌种相对适宜的生长条件, 极大提高培养效率等。还综述了近些年国内外人体肠道细菌培养组研究的最新进展, 分别从人体肠道细菌的组成特征、肠道细菌培养组学的研究成果, 培养组学的不足等方面进行了论述, 探讨了肠道细菌的培养组学在人体疾病防治领域应用的可行性。虽然作为一个新兴的研究思路, 培养组学还存在很多不够成熟的方面, 但不可否认的是它的发展前景十分可观。培养组学和其他研究方法的互补或许会成为下一个研究微生物的突破口。

人体肠道细菌; 培养组学; 进展

0 前言

肠道菌群是人体十分重要的器官, 与人体健康联系紧密。肠道细菌的培养组学的研究显得越来越重要。理由如下有如下4点: (1)宏基因组学等非培养手段, 发现了大量未培养菌株信息, 未培养菌株约占70%[1]。许多在样品中占据优势地位的种属, 尚无已培养的参考菌株; 一些标签序列仅能分类到非常粗糙的分类层级(例如细菌界或者某个门), 提示整个大的分类单元(例如大量的候选门candidate phylum)在培养菌种库中的缺失。这些信息的缺失, 正阻碍着元基因组领域的发展。(2)这些在培养中大量缺失的分类单元, 急需通过分离培养代表菌株, 研究其功能, 以推断在相应环境中菌群的功能; 同时, 通过测定分离菌株的基因组信息, 有助于元基因组测序的序列拼接与注释, 进而促进海量测序信息的准确解释。(3)通过元基因组、微生物组等新技术发现特定疾病或环境中某些菌株的作用, 除了通过非培养技术验证外, 常需要通过分离培养对应的菌株进行功能验证, 并进一步用于干预研究。(4)从资源和应用微生物角度, 如此大量的未培养菌株, 以及各种在环境以及人体内发挥重要功能的未培养菌株, 提示着一次新的“微生物猎人”的黄金时期正在我们的眼前。

肠道培养组学将此前从未在人体肠道中被分离的菌种成功培养, 也发现了许多适合微生物培养的条件以及新的培养基; 但也存在着工作量大、测序步骤繁琐、培养条件过于苛刻等缺点。本文综述了近些年国内外人体肠道细菌培养组研究的最新进展, 分别从人体肠道细菌的组成特征、肠道细菌培养组学的研究成果, 培养组学的不足等方面进行了论述。

1 人体肠道细菌的组成和特征

肠道菌群被公认为是人体重要的“微生物器官”, 与免疫、营养、代谢等诸多生理功能紧密相关[2-3], 如分解食物、微调免疫系统、分泌维生素K等营养物质、“吞”掉食物残渣、生物拮抗、促进生长、抗衰老、抑制肿瘤等。

人体消化道菌群研究方面的许多挑战与胃肠道的微生态有关, 人类在出生伊始有着无菌肠道, 但随着分娩和哺乳, 人体肠道菌群环境逐渐形成并发展成熟。对于自然分娩的婴儿来说, 菌群主要来源于母亲产道, 而剖腹产婴儿则多来源于母亲皮肤以及环境中菌群。另外母乳喂养也对婴儿肠道菌群的形成有重要影响[4]。很多研究都证明了人体肠道菌群的复杂程度是难以想象的。而在某些情况下, 肠道菌群与人体内环境的平衡状态被打破, 就会引起菌群失调, 导致疾病的发生或加重病情。肠道菌群结构发生紊乱会影响宿主的健康甚至引发疾病, 如消化不良、消化道感染[5], 肥胖症[6-7], 肿瘤[8-11], 糖尿病(I型和II型)[12], 血栓形成[13]等。

人体消化道提供150—200平方米的表面积用于微生物的定植或短暂占据, 此处的共生微生物多达1000种[14], 细菌超过50种, 其中有10种居住在结肠[15]。小肠内几乎没有细菌, 而近端结肠和远端结肠在肠道菌群组成方面差异很大[16]。相比与胃和小肠, 结肠的菌类数量和密度更高。而且即使是在同一个肠段的不同结构层次(如肠壁和黏膜), 菌的种类和数量也不尽相同[15]。最初估计成人胃肠道含有1014个细菌, 是人体细胞的10倍[17]。这些菌群分为益生菌、致病菌、中性菌, 作用各不相同。

从分类学上来说, 组成人体肠道菌群的主要有四个门: 厚壁菌门( Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。其中厚壁菌门和拟杆菌门占绝大多数。肠道菌群主要是由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成, 其中厌氧菌占99%以上。肠道菌群有数百个种系, 其中80%仍旧未被成功培养。在肠道中检测到的10个细菌门中, 厚壁菌, 拟杆菌和放线菌占优势, 其中厚壁菌门是最多的[18]。在基因方面, 肠道菌群大约有3.3万个非冗余的元基因组参考基因, 这个数量约是人类本身基因的150倍[19]。

2 培养组学的发展

在传统的微生物学研究中, 培养技术一直是一个重要的方法。但由于技术和条件的限制, 绝大多数的人体微生物无法人工培养成功, 于是宏基因组学应运而生。宏基因组学通过提取一个生物环境中的全部微小生物的遗传物质, 并进行测序, 然后分离鉴定对比, 确定微生物的种类和数量。这种方法的发展极大地扩充了我们已知的人体微生物数量。但宏基因组学也存在自身的许多缺陷, 比如宏基因组学对低浓度群体(低于105CFU·mL-1)并不敏感, 难以识别出其可靠的分类学特征, 这个问题被称为“深度偏差(depth biases)”。目前有限的培养组学研究表明, 人类肠道中的微生物多样性比基于基因组和宏基因组分析的预测要宽得多[20]。而且宏基因组学得到的DNA片段里也有相当一部分是难以识别和归类的。另外, 高通量测序的结果也受到广泛方法异质性, 也就是不同研究者在细菌生长时所使用培养基、提取方法、光谱数据库、制造商和生物信息学软件不同所导致的影响[21]。于是研究者们又把研究思路转向了传统的研究方法——培养。培养组学(culturomics)应运而生。

培养组学最初是在2012年被提出, 它基于培养条件的多样化, 尽可能地模仿细菌所处的自然环境, 以获取培养物, 结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF), 并在必要时进行16S rRNA基因扩增和测序, 以鉴定细菌菌落。培养组学被认为是宏基因组学的一个有效补充, 在Angelakis等人的概念验证研究中, 只有约15%的细菌物种通过培养和焦磷酸测序在所研究的三种粪便样品中同时检测到。在种属水平和物种水平都观察到这种互补性[22]。培养组学的大体思路是基于传统的培养方法, 结合测序法对微生物进行鉴定。首先对样品进行多重条件的培养, 对得到的培养物使用MALDI-TOF和16S rRNA进行基因测序分析, 在分类学上进行相似性的对比, 从而探索细菌组成。

3 培养组学可以用来挖掘肠道中新的微生物

培养组学可以用来鉴定发现新的菌种。在Abdallah等人进行的培养组学研究中, 有1000多种人类肠道中的细菌被分离出来。该1000多种细菌中, 有247种被证明是由培养组学新得到的[23]。Hamad等人使用培养组学的方法, 从14个粪便样品中分离出共17800个真菌菌落, 并鉴定出41种真菌菌种, 其中10种以前未在人类肠道中报道过。其团队认为将培养组学和基于扩增子的宏基因组学方法相结合可能是分析人类肠道真菌组合物的新策略[24]。Dubourg等人对来自用大规模抗生素治疗的患者的四个粪便样品进行了培养组学研究, 以评估其与其他培养依赖性研究相比较其肠道菌群的多样性。研究者总共测试了77种培养条件, 产生了32000个不同的菌落, 确定了190种细菌种类, 其中9种在该研究之前未从人类肠道分离出来, 有7种在人类肠道细菌中首次被描述, 并发现了8种全新的物种。证明了抗生素引起的肠道菌群的改变受多种条件影响, 残留菌属并不完全取决于抗生素[25]。

Pfleiderer等人首次在神经性厌食症样本上进行了培养基组学研究, 测试了88种培养条件, 产生了12700种不同菌落, 并对培养结果进行MALDI-TOF鉴定, 对未鉴定结果进行了16S rRNA的放大扩增和测序。最终在四个门中鉴定出了133种细菌种类。其中有19种此前从未从人类肠道中分离出来, 有11种属于新的细菌种类。在此, 焦磷酸测序的结果只与培养组学的结果的17%有重叠, 证明了肠道菌群库中有数量可观的新细菌[26]。

益生菌是肠道内对人体健康有促进作用的一种菌群。Tidjani等人使用培养组学和宏基因组学的方法, 确定了12种或可以作为益生菌的备选细菌, 这些益生菌可以在健康肠道中与其他菌群共生, 不会产生有害物质, 而且可以促进健康的肠道环境特征, 恢复被破坏的肠道菌群多样性, 此类益生菌可以用来进行肠道菌群移植, 治疗急性严重营养不良。其中, 宏基因组学鉴定出的DNA一部分来自已经死亡的生物, 而培养组学不存在这样的问题, 可以与其形成互补, 十分适合此类研究[27]。Seck等人从患有急性营养不良的4个月大尼日利亚患儿取粪便标本, 使用培养组学方法, 发现了一种新的细菌物种芽孢杆菌[28]。值得一提的是, Lagier等人从不同的三种粪便样本中得到了174种新的细菌物种, 这些物种此前从未在人类肠道微生物群中报道过[20]。

在肠道微生物的研究中, 与肥胖相关的肠道微生物群的变化性质是一个争议的主题, 目前宏基因组学方法的一个缺点是不同研究方法之间存在较大的差异。由于小肠微生物的浓度相比于结直肠来说要更低, 难以通过测试粪便样品来评估其变异, 因此放大了宏基因组学的缺点。Angelakis等人使用宏基因组学和培养依赖性研究方法分析肥胖患者的小肠和粪便标本, 并认为小肠标本在研究与肥胖有关的肠道微生物组成时是比粪便标本更合适的样本[22]。以上研究成果都是使用培养组学或培养依赖性方法发现新菌种的实例。

近来Jacquemond等人使用了培养组学和DNA宏条形码分析, 研究了健康女性和患有月经中毒休克综合征(mTSS)的女性阴道微生物的群落组成与月经时使用的卫生棉条上定植的金黄色葡萄球菌之间的关系。研究者们发现在40%的健康女性与100%的患病女性月经液中检测到金黄色葡萄球菌。另外, 研究者们使用标准生色培养基(normative chromo­genic media)培养提取的月经液, 在108个月经液样品中的82个中检测到菌落。共鉴定出51属和96种不同的物种。并发现卫生棉条使用持续时间对阴道可培养微生物群的组成显示出显着影响。培养组学数据的类间分析(between-class analysis, BCA)表明阴道微生物群的组成根据金黄色葡萄球菌的存在而不同[29]。该实验也验证了此前Lagier等人提出的, 在复杂的生态系统如肠道微生物群中, 与培养无关的技术无法检测到<106个·mL-1的细菌[20]。

4 培养组学发现了多样化的培养条件和营养成分

Rettedal等人以区分细菌表型分类作为培养基设计的出发点, 并对培养结果进行高通量测序, 证明了这种方法可以培养出良好的人体肠道细菌, 而且这些细菌难以使用非培养方法与其表型建立联系。这些研究已经确定了一些可以帮助提高肠道细菌提取率的因素, 优化的培养程序允许通过将选择性培养条件与系统发育标签测序直接偶联来进行表型的多重作图。这种方法的优点是在得到培养结果的同时就可以提供相关的表型信息。例如, 他们通过使用特定的抗生素来限制培养物中可以被提取出的细菌种类, 在这种抗生素选择压力培养基得到的结果中, 他们发现拟杆菌门(Bacteroidetes)的细菌有一部分与泛耐受表型相关, 这体现了拟杆菌作为抗生素抗性库的潜力[30]。该方法还有可能用于鉴定底物特异性利用表型以及其他耐受表型。

在培养基优化的方面, 由于研究菌种的不同, 优化的方向也不尽相同, 很难找到一个简化方案的“金标准”。培养组学的出发点就是将不同培养条件进行组合, 得到尽可能多的培养结果, 从而从中发现新的菌种。根据研究目标的不同特点对培养基进行个性化优化是至关重要的一步。Ghodbane等人就通过优化培养基, 控制培养条件, 成功地将结核分枝杆菌所需的培育时间大大缩短。并且培养结果经过了MALDI-TOF鉴定[31]。

在Lagier等人的研究中, 使用了212种不同的培养条件, 但培养出来的全部物种可以仅在其中70种培养条件下完全生长, 73%的物种仅使用其中的20种培养条件即可得到。这或许提示了有一些培养条件是许多细菌培养的共同所需的, 在今后培养基的设计上或可借鉴[20]。

5 培养组学的不足与发展前景

培养组学作为一个新兴的菌群研究方法, 依然存在一些不足。首先, 培养组学方法可以得到大量菌种, 均需要进行分离鉴定, 其中不乏依靠高通量测序方法难以检测出的少数菌种, 因此培养组学面对的困难之一就是细菌鉴定的效率低, 成本高。但随着MALDI-TOF的发展和应用, 这个问题正在解决当中。相对于目前被认为是金标准的高通量测序技术, 质谱法分离鉴定过程的时间和金钱成本都大大降低了[20, 32]。MALDI-TOF并不是一种真正的分型方法, 而是根据微生物不同的表型特征使分离菌聚集, 从而起到鉴别分型的作用, 将分离物与数据库进行比对鉴定, 相似度<98.7%的即可被认为是新物种。其在鉴定细菌、真菌, 预测抗生素的耐药性, 微生物分类方面都有良好的表现。Gregory等人认为MALDI-TOF将成为临床微生物学实验室中的常规鉴定方法, 是完善培养组学技术的关键元素, 可以使培养组学技术更好地与宏基因组学测序技术形成互补[21]。

很多科学家面对的另一个困难是, 大多数的细菌不会在经典的培养基上生长, 这些最初的研究使用延长培养时间和严格控制厌氧条件, 设计扩散室(diffusion chamber)[33-34]等方法来模拟这些在传统意义上无法培养的菌种在自然环境中的生长条件[35]。而且, 尽管培养技术已经取得了一些进展, 但目前人们依然普遍认为, 人类肠道微生物群的培养依赖于大多数实验室无法轻易实施的复杂技术和精密条件, 所以简化培养程序, 继续发展新的培养技术可以作为改善培养组学方法的一个突破口。

6 结论与展望

在人类肠道菌群的研究中, 培养组学为宏基因组学提供了有效的互补, 开拓了人体微生物研究的新思路, 发展至今短短几年中已经被应用于很多方面的研究, 亦有很多新菌种通过培养组学方法被发现, 因此培养组学具有很大的发展潜力。但由于培养组学是一个相对较新的研究策略, 仍有一些问题亟待解决。在这些发展方向里, 对于培养基的重新设计、培养条件的优化应当被给予重视, 这也是培养组学的核心部分。

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Research progress in human gut bacteria culturomics

NIU Shangbo1,2, CAI Jiayu2, WEI Jintao2, HUANG Jiawei2, FANG Shuting2, WU Jiguo2, ZHANG Guoxia2,*

1. The First Clinical Medical Collage, Southern Medical University, Guangzhou 510080, China 2. Department of Environmental Health, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou 510080, China

Human microbiota studies have shown that humans intestinal bacteria are closely related to human health. A variety of bacteria in human intestine constitute enterobacterium, which is the largest part of the human microbiome. Metagenomics, an universal technology (or method) for intestinal microbiome study, has ‘depth biases’ and other disadvantages, which promotes the development of human intestinal microbial culturomics. The human gut bacteria culturomics is a research hotspot among these years, which can help researchers reduce the biases of metagenomics in some cases. The diversity of cultural conditions could also help us to find which is the relatively suitable one, and promote the efficiency. We reviewed the newly reported progresses in human gut bacteria including the characteristics of the composition of human intestinal bacteria, the study consequences of the intestinal culturomics, and the shortages of this skill. We also discussed the feasibility of the application of intestinal bacteria culture group in disease prevention and treatment. Although as an emerging research idea, there are still many immature aspects in culturomics. It can not be denied that its development prospects are very impressive. The complementarity between culturomics and other research methods may be the next breakthrough in microbes researching.

human intestinal bacteria; culturomic; progress

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.02.027

Q939.1

A

1008-8873(2020)02-227-06

2018-11-21;

2019-01-11

国家自然科学基金青年基金项目(31500076)

牛尚博(1996—), 男, 河北邢台人, 临床医学八年制学生, 主要从事肠道培养组学研究, E-mail:nsbetter@qq.com

张国霞, 女, 博士, 南方医科大学公共卫生学院副研究员, 硕士生导师, 主要从事肠道微生物培养组学和大气生物气溶胶微生态研究E-mail: guoxiazhang@126.com

牛尚博, 蔡嘉裕, 韦金涛, 等. 人体肠道细菌的培养组学研究进展[J]. 生态科学, 2020, 39(2): 227–232.

NIU Shangbo, CAI Jiayu, WEI Jintao, et al. Research progress in human gut bacteria culturomics[J]. Ecological Science, 2020, 39(2): 227–232.