SARS-CoV-2感染机制分析与COVID-19治疗药物研究进展

王康泓

(深圳大学生命与海洋科学学院,中国广东 深圳 518060)

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)感染引起的疾病于2020年2月11日被世界卫生组织命名为2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)[1～2],其蔓延是近 20 年世界范围内第3次冠状病毒大流行。SARS-CoV-2与SARS-CoV[3]和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)[4]同为冠状病毒,但与它们相比,SARS-CoV-2具有传染性强[5～7]、潜伏期长[6]、人群普遍易感[7]、早期感染症状不明显及存在无症状感染者[8]等特点,这些特点将更利于SARS-CoV-2在人群间传播。多项研究表明,在缺乏人为干预的条件下,SARSCoV-2的基本再生数(R0)将高于SARS-CoV和MERS-CoV[5～7],这与目前 SARS-CoV-2 在世界范围内蔓延的现状相符。此外,SARS-CoV-2可通过密切接触传播、飞沫传播、粪口传播等多种方式传播[9～10],丰富的传播方式使SARS-CoV-2具有更强的适应能力,可广泛流行于不同国家和地区。截至2020年11月25日,全球范围内超200个国家出现了COVID-19患者58 900 547名,死亡人数达到1 393 305[11]。尽管COVID-19疫情在我国本土得到了较好的控制,但随着疫情在世界范围内的流行,防疫工作依旧严峻,对SARS-CoV-2的深入研究仍十分有必要。因此,本文将从SARSCoV-2基因组序列分析及其溯源、由血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)介导的病毒入侵过程和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(第三版至第七版)提出的COVID-19现有治疗药物3个方面,对SARS-CoV-2的遗传特点、传播方式、感染致病机理及其引起的COVID-19的现有及潜在有效药物展开综述。

1 SARS-CoV-2的基因组序列分析及溯源

1.1 SARS-CoV-2的序列分析

基于序列同源性比对及系统发育分析的生物信息学手段在预测病毒基因组结构及其编码产物、估算病毒突变速率、追溯病毒起源及其进化等过程中起到重要作用。通过对国家基因组科学数据中心早期发布的5株SARS-CoV-2毒株的基因组序列(序列号分别为GWHABKF00000000、GWHABKG00000000、GWHABKH00000000、GWHABKI00000000、GWHABKJ00000000)进行分析可知,SARS-CoV-2基因组全长约29.8 kb,其正链编码12个氨基酸组成数超过75的蛋白质[12]。研究表明,SARS-CoV-2基因组从5′端至3′端的组成顺序为 5′非翻译区(5′-untranslated region,5′-UTR)、病毒复制酶系(open reading frame 1ab,ORF-1ab)编码区、刺突蛋白(spike protein,S)编码区、包膜蛋白(envelope protein,E)编码区、膜蛋白(membrane protein,M)编码区、核衣壳蛋白(nucleoprotein,N)编码区和 3′非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)[9,13]。值得一提的是,SARS-CoV-2具有典型的β-冠状病毒的序列末端特征[9]。

针对上述5株SARS-CoV-2的基因组序列的比对结果显示,它们在非编码区的104、111、112、119、120、124 位及编码区的 3 778、6 996、7 866、8 388、8 987位存在核苷酸差异[12],提示SARS-CoV-2基因组中某些位点易发生突变,且这些突变已出现在早期(2020年1月26日前)分离的毒株中。其他研究结果显示,SARS-CoV-2基因组在 6 943、8 737、8 789、11 739、20 646、20 655、24 031、27 469、28 120、28 151、28 299 位存在多个易突变位点[14～15],进一步验证了该病毒的高突变率[16]。进一步分析可知,除 3 778、6 943、11 739、27 469、28 120位点发生同义突变外,其余突变位点的核苷酸变化将引起其编码蛋白质的一级结构发生改变,从而对蛋白质的极性、构象、活性产生影响。以上结果意味着SARS-CoV-2可能在传播的过程中通过变异产生多种特点各异的毒株,并相应地进化出新的传播途径和入侵逃逸机制。已有研究发现,SARS-CoV-2通过自然突变引入了一个β-冠状病毒所不具备的Furin蛋白酶切位点,该变异不但提升了病毒的入侵效率,而且对SARS-CoV-2的入侵机制具有一定影响,使其感染宿主的方式可能更接近于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和埃博拉病毒[17]。可预见地,针对SARS-CoV-2的药物及疫苗研发将因为该病毒的突变而变得更加困难。

此外,基于基因组序列分析结果进行的SARS-CoV-2分型及病毒变异速率估算的相关研究也取得了一定的进展。一项以103个SARSCoV-2基因组序列为样本的群体遗传学分析结果表明,可根据SARS-CoV-2基因组中8 782位和28 194位这一对关联性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)将该病毒分为S与L两个亚型;与其他冠状病毒基因组序列的比对结果显示,S型SARS-CoV-2为更古老的毒株;针对不同亚型毒株表达产物的分析结果显示,新产生的L型毒株具有更强的传染性及攻击性,在疫情流行初期传播得较为迅速,但随着“封城”等强力干预措施的执行,毒力较低的S型毒株可能因为其传播的隐蔽性而得到更广泛传播[18]。早期的研究结果表明,在自然界的冠状病毒中每个核苷酸每年的平均突变速率约为10-4[15,19]。根据已有的SARS-CoV-2基因组数据推测,该病毒的突变速率为 1.19×10-3～1.31×10-3[20],与同为冠状病毒属的SARS-CoV(每个核苷酸每年发生1.16×10-3～3.30×10-3次同义突变及 1.67×10-3～4.67×10-3次非同义突变)和MERS-CoV(每个核苷酸每年发生1.12×10-3次突变)具有同一数量级的突变频率[21～22],提示SARS-CoV-2与SARS-CoV和MERS-CoV的进化速率大致相同,但快于自然界冠状病毒的平均进化速率。

综上所述,SARS-CoV-2基因组序列的解析为病毒基因组结构及各基因表达产物的预测提供了直接证据,其序列比对结果在揭示该病毒存在大量易突变位点的同时,也为病毒的分型及进化速率的估算提供了数据支持。随着COVID-19流行时间的增加,SARS-CoV-2将不可避免地产生大量突变。因此,对SARS-CoV-2潜在突变位点进行监视并预测突变后病毒的表型对COVID-19的防控具有指导作用。更重要的是,除了对已明确的L型和S型毒株进行监控外,还需进一步检测是否有毒力更低的新型毒株出现。更具隐蔽性的低毒力毒株可能会造成大批无症状感染者的出现,并引起COVID-19的二次流行。此外,利用SARS-CoV和MERS-CoV基因表达产物构建无复制能力的高滴度假病毒的研究已经取得成功,提示构建模拟RNA病毒状态的SARS-CoV-2假病毒具有一定可行性[23～24]。假病毒的构建可推动SARS-CoV-2的免疫学研究,为相关药物及疫苗的研发奠定基础。因此,对SARS-CoV-2序列进行深入研究仍十分必要。

1.2 SARS-CoV-2的溯源

SARS-CoV-2及相关冠状病毒的基因组系统发育分析结果显示,SARS-CoV-2是一种Sarbecovirus亚属的新型β-冠状病毒[15]。研究者对同为冠状病毒属的SARS-CoV和MERS-CoV进行传播途径溯源,发现它们分别通过蝙蝠-果子狸-人途径和蝙蝠-骆驼-人途径进行传播并最终感染人类[25～27]。基于上述结果推测SARS-CoV-2很可能也通过“天然宿主-中间宿主-人”的模式进行传播。

目前,研究者普遍认为蝙蝠是SARS-CoV-2的天然宿主。全基因组序列分析结果显示,SARSCoV-2与BatCoV RaTG13的基因组相似性高达96%以上,提示SARS-CoV-2大概率起源于蝙蝠[18,28]。另一项基于β-冠状病毒基因组特有的互补回文序列及其编码区的溯源分析结果显示,SARS-CoV-2来自于菊头蝠[26]。尽管目前仍不确定SARS-CoV-2具体源于哪一种蝙蝠,但蝙蝠是该病毒天然宿主的结论基本没有争议。

对于SARS-CoV-2的中间宿主,目前存在较大分歧。Yang等[9]根据多种动物分离出的冠状病毒毒株序列的同源性比对结果得出,蛇与穿山甲是SARS-CoV-2的潜在中间宿主,但Zhang等[29]通过大数据集的生物信息学分析反驳了蛇是该病毒中间宿主的推断。尽管SARS-CoV-2与穿山甲冠状病毒具有较高的同源性[18],但有研究发现,SARS-CoV-2具有穿山甲冠状病毒所不具备的PRRA肽段,提供了感染人类的SARS-CoV-2并非直接来源于穿山甲的证据[20]。此外,一项基于密码子偏好性的研究发现,在SARS-CoV-2基因组中编码精氨酸的“CGG”密码子的相对频率为3.14%,与蝙蝠的2.59%存在一定差距,提示该病毒从天然宿主传播到人类的过程中存在至少1种利用“CGG”密码子相对频率较高的动物作为过渡;该研究团队根据SARS-CoV-2检测阳性的动物样品及华南海鲜市场交易的动物推断,狐狸和鹿可能是SARS-CoV-2的中间宿主[17]。

在利用中间宿主作为传播媒介的同时,冠状病毒在不同宿主体内发生的遗传重组将促进其进化,进而产生对人类更具威胁的新表型[9,19]。此外,SARS-CoV-2的长期流行可能使更多的动物成为宿主,从而使其传播网络变得更加复杂。因此,需要广泛地对不同国家和地区在不同时间分离的SARS-CoV-2毒株进行分析,在明确该病毒中间宿主的同时根据宿主动物的活动轨迹及生活方式进行针对性防控。对SARS-CoV-2检测呈阳性的动物宜采取人为干预措施,尽可能切断病毒的传播、进化途径。

2 ACE2介导的病毒入侵机制

2.1 ACE2的组织定位及生物学功能

刺突蛋白与宿主细胞表面受体的识别是冠状病毒侵入靶细胞的关键。针对SARS-CoV-2刺突蛋白结构模拟计算的结果显示,该病毒具有与SARS-CoV相似的受体结合域(receptor binding domain,RBD),表明SARS-CoV-2也是通过宿主的ACE2侵入靶细胞[25]。因此,明确ACE2的组织定位及生物学功能对COVID-19发病机制的研究及相关药物的研发具有指导作用。

TCGA(The Cancer Genome Atlas)、FANTOM5(Functional Annotation of the Mammalian Genome)等数据库中单细胞RNA测序的结果显示,ACE2在心脏的心肌细胞、肺泡的Ⅱ型肺泡细胞(alveolar typeⅡ,AT2)、食道的层状上皮细胞、回结肠的上皮细胞、肾近端小管细胞、膀胱及尿路上皮细胞等多种细胞中高水平表达[30～31],提示以上多个器官或组织可能成为SARS-CoV-2的潜在感染位点。

ACE2密切相关的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在人体内环境维持和炎症反应的过程中起重要的调节作用。该系统由ACE-血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)-血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R)轴与 ACE2-Ang1～7-Mas(Ang1～7 对应的受体)轴组成,且后者对前者具有拮抗作用[32]。在ACE2-Ang1～7-Mas轴中,ACE2作为经典RAS系统的拮抗剂,通过降低AngⅡ的水平起到维护心血管功能、对抗炎症反应等作用;Ang1～7可减少巨噬细胞的浸润并降低单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的水平,在炎症反应的对抗中起重要作用[32]。正常条件下,RAS轴间的活性水平处于动态平衡,相应系统的功能也保持稳定[33～34]。若ACE2的水平出现下降,RAS轴间的动态平衡将因为ACE2拮抗作用的下调而被打破,ACE-AngⅡ-AT1R轴介导的炎症反应加重,使机体受到相应的炎症损伤[35]。综上所述,ACE2作为经典RAS轴的抑制剂,可通过减轻ACE-AngⅡ-AT1R介导的炎症反应降低机体受到的炎症损伤,最终对相应器官或组织起到保护作用。

2.2 ACE2在病毒入侵及COVID-19发展过程中行使的生物学功能

冠状病毒对宿主靶细胞的感染需先后经历S1蛋白介导的受体结合过程和S2蛋白介导的膜融合过程[28],前过程中病毒刺突蛋白与细胞受体的相互作用是病毒得以特异性侵入的关键。针对SARS-CoV感染机制的研究发现,ACE2基因敲除小鼠对SARS-CoV的敏感性较低,该小鼠因感染产生的肺损伤和病毒滴度远低于野生型小鼠[36],说明ACE2的表达是SARS-CoV入侵和致病的关键。SARS-CoV-2与SARS-CoV的RBD高度相似,该特征在揭示ACE2是以上两种病毒的共同入侵靶点的同时,提示了它们可能具有相似的入侵机制和致病机理[25]。因此,ACE2的深入研究可进一步明确病毒入侵所造成的病理生理改变,为COVID-19的诊疗提供支持。

COVID-19患者的临床分析结果显示,患者在出现发热、乏力、干咳、咽痛、腹泻、呼吸困难及双肺感染等临床症状的同时伴随着多种细胞因子水平升高[5,10,37～39]。包括 IL-1B、IL-RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、干扰素-γ (interferon-γ,INF-γ)、干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)、MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白1A(macrophage inflammatory protein 1A,MIP1A)、MIP1B、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、TNF-α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在内的多种细胞因子的升高说明COVID-19患者免疫系统在对抗SARS-CoV-2感染的过程中引发了炎症因子风暴[34,37]。炎症因子风暴的引发将进一步造成急性肺损伤乃至器官衰竭,使患者病情迅速恶化[37]。对以上指标的进一步分析发现,ACE2下调造成的RAS系统失衡的相关炎症因子 MCP-1、IL-6、TNF-α 参与了 COVID-19 炎症因子风暴的产生。此外,有研究发现COVID-19患者血浆中AngⅡ的水平明显升高,且该水平与SARS-CoV-2的滴度及肺损伤的严重程度密切相关[37]。

以上研究结果表明,SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2结合所产生的一系列病理生理改变是COVID-19发展的关键。SARS-CoV-2感染后造成的改变如下:在SARS-CoV-2感染的初期,病毒的侵入及非特异性免疫系统的激活造成宿主相应组织中ACE2下调,与之相关的RAS轴间的动态平衡随之被打破,造成AngⅡ和包括MCP-1、IL-6、TNF-α在内的多种细胞因子的水平上升;随着非特异性免疫系统的激活,中性粒细胞和巨噬细胞向感染部位募集并活化,在清除感染细胞的同时释放相应的炎症因子和趋化因子,并在激发特异性免疫系统的同时进一步下调ACE2的表达水平[34～35,38,40]。特异性免疫系统的激活将进一步扩大免疫反应,引发炎症因子风暴,最终造成COVID-19患者出现相应的脏器病变[34～35]。因此,可尝试对COVID-19患者血浆的AngⅡ、炎症因子风暴相关细胞因子和C反应蛋白、乳酸脱氢酶等肺部损伤相关指标进行检测,并根据这些指标的水平对COVID-19的发展做出预判,防止病情恶化[36]。

为进一步揭示ACE2在SARS-CoV-2入侵及COVID-19发展过程中所行使的生物学功能,明确受体结合过程与SARS-CoV-2传染性、致病性的关系,研究者开展了针对冠状病毒刺突蛋白和受体ACE2的分子水平的研究。利用冷冻电镜对表达纯化的S1蛋白开展的生物物理分析显示,SARS-CoV-2与人ACE2的结合能力是SARSCoV 的 10～20 倍[41～42]。SARS-CoV-2 和 SARS-CoV的同源性比对结果显示,尽管二者同源性高达79%,但在其RBD的6个关键氨基酸残基中有5个不同,说明SARS-CoV-2与宿主的高亲和性与病毒RBD区域的进化相关[18,41,43]。进一步的研究分析发现,包括455位亮氨酸残基、486位苯丙氨酸残基、493位谷氨酰胺残基和494位丝氨酸残基在内的多个RBD区域的氨基酸残基为病毒与人受体的结合提供了良好的相互作用;需要指出的是,RBD区域501位的天冬酰胺残基与人ACE2的结合不理想[44]。该结果说明,SARS-CoV-2的RBD区域虽然对人ACE2受体具有一定的高亲和性,但仍存在一定的进化空间,当特定位点的氨基酸残基突变为与人ACE2亲和性更强的残基时,该病毒的感染能力和传播速度将进一步提升。

ACE2及冠状病毒刺突蛋白相关分子水平的研究也有助于COVID-19潜在治疗方法的寻找。SARS-CoV的早期研究显示,宿主的人肿瘤坏死因子-α转化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme,TACE)、丝氨酸蛋白酶TMPRSS2和胰蛋白样蛋白酶HAT在病毒的入侵过程中起重要作用[45～47]。TACE是SARS-CoV入侵所必需的生物分子,体外细胞实验结果表明,TACE抑制剂TAPI-2可通过阻断SARS-CoV受体结合过程中TNF-α产生的细胞信号降低病毒的感染能力[47～48]。TMPRSS2和HAT对冠状病毒刺突蛋白的切割为病毒活化所必需,且TMPRSS2对ACE2的切割将进一步促进病毒的进入[46]。位于ACE2受体第697～716位的精氨酸残基和赖氨酸残基对TMPRSS2生物学功能的行使起重要作用,这些残基的突变将直接造成TMPRSS2对ACE2切割能力的下降[46]。由于SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2的结合也需要经历上述生物学过程,因此,对TACE、TMPRSS2和HAT具有抑制作用的相关药物可能对COVID-19的治疗具有较好的效果。此外,有研究根据SARS-CoV-2 RBD区域中保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)基序进行推测,认为整联蛋白可作为SARS-CoV-2入侵的替代受体,故该蛋白质也可能是COVID-19的潜在治疗靶点[49]。

3 COVID-19治疗药物的研究进展

3.1 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》的推荐药物

国家卫生健康委员会于2020年1月15日至3月3日相继发布了七部试行版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(下称《诊疗方案》),每一版《诊疗方案》的修订均结合了最新的治疗进展,其推荐的参考药物对COVID-19的治疗具有深刻的指导意义。

《诊疗方案》(试行第三版)在治疗COVID-19的推荐药物上提出了4点建议,分别是α-干扰素的雾化吸入、使用洛匹那韦/利托那韦进行治疗、根据病情的进展使用糖皮质激素、根据基本病机特点推荐相应的中药处方[50]。作为广谱的抗病毒药物,α-干扰素可通过诱导免疫系统和干扰病毒的复制阻止病毒的增殖[51]。洛匹那韦是一种蛋白酶抑制剂,在艾滋病的治疗中得到广泛应用,该药物通过阻断Gag-Pol聚蛋白分裂使HIV无法产生有感染力的成熟病毒颗粒;利托那韦可抑制细胞色素P450A介导的洛匹那韦的快速代谢,提高血浆中洛匹那韦的浓度,二者常联合用药[52]。冠状病毒基因组编码的木瓜样蛋白酶和3C样蛋白酶是冠状病毒增殖、侵染等生物学过程所必需的蛋白酶[53～54],故推测洛匹那韦/利托那韦通过抑制SARS-CoV-2中毒蛋白酶的活性来阻止病毒的增殖和侵染。糖皮质激素的使用是一把“双刃剑”。一方面,糖皮质激素具有抗炎、免疫抑制、抗毒素的作用,早期合理的使用可减轻危重症COVID-19患者的炎症反应[55～56]。另一方面,免疫抑制造成的CD4+淋巴细胞下降不利于病毒的清除[55],更严重的是,长期大剂量地使用糖皮质激素会造成股骨头坏死、骨质疏松等一系列严重的后遗症[57～58]。因此,对于糖皮质激素的使用仍需要持谨慎的态度。《诊疗方案》(试行第四版)在明确洛匹那韦/利托那韦具体用量的同时,提出恢复期血浆治疗、静脉注射血必净治疗、肠道生态调节剂治疗等治疗方案[59]。此外,该版《诊疗方案》在中医药诊疗上明确了不同分型病人的临床表现,并根据病情进展的分型推荐了处方[59]。《诊疗方案》(试行第五版及其修正版)提出了利巴韦林的使用并对其用量加以修正[60～61]。利巴韦林的三磷酸代谢产物可作为病毒RNA合成的底物掺入到新合成的病毒基因组中,从而通过引发病毒的致死突变来抑制病毒的增殖[51]。《诊疗方案》(试行第六版)在纳入阿比多尔和磷酸氯喹等推荐药物的同时,进一步明确了中西医结合的治疗方针[62～63]。阿比多尔是一种膜融合抑制剂,该药物可能通过阻止SARS-CoV-2与人细胞膜的融合来阻断病毒的入侵[51]。磷酸氯喹属于氨基喹啉类抗疟药物,可能通过干扰ACE2末端的糖基化和上调病毒膜融合过程的pH值来抑制SARS-CoV-2的感染;该药物的初步临床试验结果表明,磷酸氯喹在COVID-19的治疗中发挥了一定的作用[51,64]。《诊疗方案》(试行第七版)在进一步明确磷酸氯喹用量的同时提出,利用托珠单抗抑制IL-6引起的炎症因子风暴,以减轻炎症因子风暴造成的病情恶化[65～66]。

结合了最新治疗进展的《诊疗方案》(试行第七版)对国内COVID-19的治疗具有深刻的指导作用。随着疫情在全球范围内的蔓延和国外对COVID-19研究的深入,其他国家发布的“诊疗指南”也具有一定的参考价值[67]。疫情在不同国家和地区的长时间流行,使得SARS-CoV-2因各地区环境及中间宿主的差异而进化出特点不同的新毒株。对其他国家的诊疗指南进行关注,可提前明确这些输入型新毒株的特点,并结合该地区的治疗方案对其引发的COVID-19进行治疗。此外,随着药物筛选及新药研发等工作的深入,国外“诊疗指南”中应用的药物也将为本土COVID-19的治疗提供更多的备选。

3.2 针对ACE2和毒蛋白酶等靶点的潜在药物

受体ACE2的存在和病毒基因组编码的毒蛋白酶生物学功能的行使是SARS-CoV-2得以入侵、增殖的关键。目前,针对ACE2受体和病毒毒蛋白酶等靶点的天然、人工合成药物在抑制SARSCoV的研究中取得了一定进展[68]。奈非那韦、缬氨霉素、氯硝柳胺、金精三羧酸、吲哚美辛等针对木瓜样蛋白酶和3C样蛋白酶的蛋白酶抑制剂在体外对SARS-CoV具有一定的抑制作用[69]。一项基于化学遗传学的研究对50 240个小分子进行了筛选,并初步鉴定出104种具有潜在抗SARSCoV活性的小分子;进一步分析发现,化合物MP576、VE607分别对SARS-CoV的毒蛋白酶活性和病毒与ACE2的结合起抑制作用,而且体外活性鉴定结果显示,上述化合物具有一定的抗SARS-CoV能力[70]。利用丙氨酸扫描技术对ACE2的带电氨基酸残基进行分析发现,ACE2的第26位和第30位氨基酸残基对SARS-CoV与ACE2的结合十分重要[71];基于此,该研究团队合成了一系列可能具有抗SARS-CoV的肽段,结果显示,由ACE2的第22～44位氨基酸残基组成的肽段和由ACE2第22～57位氨基酸残基组成的肽段具有明显的抗SARS-CoV活性,由ACE2第22～44位氨基酸残基和第351～357位氨基酸残基连接而成的肽段具有更加显著的抗病毒能力[71]。

以上结果表明,包括小分子化合物和抗生素在内的蛋白酶抑制剂可能通过抑制冠状病毒基因组编码的木瓜样蛋白酶和3C样蛋白酶的催化活性来阻止病毒的增殖;具有与人ACE2功能性残基相似组成结构的人工肽可与病毒提前结合,通过阻断受体与病毒RBD区域的相互作用而达到抗病毒的效果。综上所述,基于ACE2和病毒毒蛋白酶等靶点的天然、人工合成药物可能成为COVID-19治疗的“特效药”,但鉴于SARS-CoV-2基因组的特异性,相关潜在药物的开发仍需要经历漫长的探索过程。

3.3 来源于中药的潜在活性成分

多项针对COVID-19患者进行的回顾性研究指出,中西医结合治疗能显著改善COVID-19患者的临床症状,在缩短轻重症患者治疗时间的同时降低重症的发生概率[5,72～73]。

随着网络药理学和生物信息学的发展,基于TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、GeneCards、STRING、Enrichr、WebGestalt(WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit)等数据库进行的一系列药物网络构建、核心靶点和通路的筛选分析以及化合物分子对接模拟是目前对传统药方中潜在活性成分进行筛选的重要手段[74～75]。研究者可根据生物利用度、类药性等条件在TCMSP数据库中获取药方的活性成分及药物作用的靶点;在OMIM、GeneCards等数据库中获取COVID-19相关靶点并构建相应的药理网络;随后通过STRING等数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,并进一步利用 Enrichr、WebGestalt等数据库进行 GO(Gene Ontology)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物通路富集分析[75～81]。经上述一系列分析可预测药方中的潜在有效化合物及其相应的调控靶点、相关通路等信息,并最终预测出最具治疗价值的核心成分。

目前,相关研究已对清肺排毒汤[75]、三消饮[76]、麻杏石甘汤[77]、藿香正气汤[78]、黄连解毒汤[79]等多个传统药方进行了相应的网络药理学分析。研究结果表明,上述药方可能通过维持RAS相关通路的平衡、抑制补体系统激活、抑制炎症反应、参与免疫调节、抑制SARS-CoV-2 3C样蛋白酶活性和抑制ACE2与病毒的结合过程等多个方面抑制COVID-19的发展,揭示了中药在COVID-19治疗中发挥的多成分、多靶点、多通路的作用特点。

4 结语

SARS-CoV-2具有潜伏期长、传染性强、人群普遍易感和传播方式多样等特点。随着全球范围内COVID-19患者的持续上升,SARS-CoV-2的全球大流行已不可避免。更严重的是,从该病毒的特点和已有的抗病毒策略来看,距SARS-CoV-2的特效药物和相关疫苗的成功研发仍有一定距离。综上所述,对SARS-CoV-2的传播进行预防仍是现阶段阻止COVID-19蔓延的最有效方法。SARS-CoV-2的传播方式提示:防止含病毒颗粒的飞沫及气溶胶的接触或吸入是阻止该病毒感染的关键[82]。因此,可通过佩戴医用外科口罩及手部清洁等措施减少含病毒颗粒物质的接触与吸入;对于存在人员流动的密闭空间,可使用乙醚、75%乙醇、氯仿等消毒剂对病毒灭活[83]。此外,随着复工复产工作的有序推进,完善疫情信息的监测更新、加快疑似病例的诊断等对现阶段所面临的聚集性疫情及院内感染的防止具有重要意义[7]。

尽管目前对SARS-CoV-2的基因组及其传播途径有了初步的认识,但随着疫情在不同国家与地区的长时间流行,病毒不但会在人与人传播的过程中发生变异,而且“天然宿主-中间宿主-人”理论传播网络也将不可避免地因为其他物种的感染而变得更加复杂。不同中间宿主所介导的遗传重组将导致更多特点各异的毒株产生,使相关药物及疫苗的研发变得更加困难。因此,对不同地区、不同时间段出现的毒株进行分离测序,对明确病毒的进化方向、寻找并切断病毒的进化传播途径具有重要意义。

针对ACE2及SARS-CoV-2刺突蛋白的研究表明,病毒刺突蛋白与受体结合后引发的一系列免疫反应和病毒本身造成的病理后果是COVID-19发展的关键。有关上述过程的分子生物学、细胞生物学、结构生物学和生物信息学的深入研究将进一步揭示SARS-CoV-2的传播、致病机制,为COVID-19控制及潜在药物的寻找提供思路。

《诊疗方案》推荐的药物结合了疫情发展过程中最新的研究进展,是目前COVID-19治疗中最可行有效的“武器”。随着SARS-CoV-2研究及相关药物临床试验的深入,潜在药物将得到进一步发掘[84],从而为COVID-19的治疗提供更多备选药物。

此外,COVID-19患者存在康复后复发和无症状感染等现象。一项基于3例COVID-19出院后核酸检测结果复阳患者的回顾性研究指出,在患者感染初期,SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的核酸检测结果呈双基因强阳性,而二次入院时的报告显示双基因弱阳性,提示核酸检测结果复阳患者的病毒载量远低于其首次入院时的病毒载量[85]。另一项回顾性研究指出,COVID-19患者存在治愈后复发且病程与临床症状、实验室指标和影像学表现不同步的现象[86]。也有研究发现,COVID-19患者在病症消失后的一段时间内仍可检测出病毒的RNA[87～88]。以上信息提示,COVID-19患者康复后复发可能与以下因素相关:第一,SARSCoV-2在体内的增殖存在消长过程,核酸检测的结果与病程不同阶段的核酸载量有关[86];第二,患者症状消失后SARS-CoV-2的排毒仍在继续,患者体内仍携带有较低滴度的病毒;第三,核酸检测试剂的灵敏度、实验人员的操作手法、环境和唾液中的RNA酶导致病毒核酸降解及患者口腔、鼻咽部病毒量低等原因造成核酸检测漏检及假阴性,使部分患者在痊愈前出院,导致复发[89]。一项基于72 314例COVID-19患者的流行病学调查显示,样本中约存在1%(889例)的无症状感染者[90]。传染病中存在无症状感染者的现象已得到广泛认可,COVID-19患者中无症状感染者的出现可能与人类基因的多态性、不同个体的抵抗力、不同毒株的毒力差异和处于潜伏期感染者被快速筛查等因素相关[91]。