幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测的研究进展

曹喜红

天津市武清区食品药品检验所 (天津 301700)

幽门螺杆菌是导致慢性胃炎及消化性溃疡等疾病的主要原因。目前，幽门螺杆菌已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌源[1]。克拉霉素是临床常用的抗幽门螺杆菌药物，为一线治疗药物，在临床治疗中取得了显著的效果[2]。近年来，随着克拉霉素在临床的广泛应用，幽门螺杆菌对其耐药性不断增强，进而使治疗效果大打折扣[3]。因此，有必要开展幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测。

1 幽门螺杆菌对克拉霉素耐药机制

2012年，马斯特里赫特Ⅳ-佛罗伦萨共识报告中明确表示，对于克拉霉素耐药性超过15%的地区，在应用克拉霉素治疗幽门螺杆菌相关疾病前应首先开展细菌培养及药敏试验。目前，人们已基本明确了幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的分子机制。克拉霉素抗幽门螺杆菌治疗的主要机制为其可与23SrRNA分子V功能域内转肽酶进行结合进而对幽门螺杆菌蛋白质的合成进行抑制[4]。但是，23SrRNA分子V功能域内在治疗过程中出现的点突变会逐渐降低对克拉霉素的亲和力，进而阻碍克拉霉素与23S核糖体亚基进行结合，产生耐药性[5]。

2 传统检测方法

传统幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的检测方法主要是分离培养-药敏试验方法，这是被学术界公认的幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测的金标准[6]。在采用分离培养-药敏试验开展幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测的过程中，如果培养液质量不合格及标本放置时间过长，或者培养环境达不到相关标准时，会在很大程度上影响检测效果[7]。同时，该方法对操作技术要求较高，费用昂贵，且不能对Hp耐药突变点位进行有效检测，难以在临床检验诊断中推广应用。

3 分子生物学检测方法

针对传统分离培养-药敏试验幽门螺旋杆菌对克拉霉素耐药性检测存在的问题，有学者提出了分子生物学检测方法。分子生物学检测方法的主要原理为通过采用分子生物学聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术来检测幽门螺杆菌23rRNA基因突变情况，进而对幽门螺杆菌关于克拉霉素的耐药性做出判断。在既往的研究中，已经形成了DNA芯片、PCR线性探针分析、肽核酸-荧光原位杂交、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性、3’错配聚合酶链式反应，以及DNA测序等一系列成熟的技术。

3.1 DNA芯片

DNA芯片技术又被称之为DNA微阵列技术，其主要原理为采用支持物对很多特定的DNA片段进行有规律的排列，然后采用荧光探针对已经标定的待测序列与支持物上的DNA片段进行杂交，并对杂交后的结果采用荧光检测系统进行分析，最终获得相应的定性及定量分析结果。基因芯片技术具有较高的灵敏性，可重复检测，并且可以对多种抗生素及多位点突变进行同时检测，大大提高了检测效率[8]。通常来说，基因芯片技术的DNA测序结果可达到95%以上的一致性。基因芯片技术的不足之处在于检测费用昂贵，难以在临床检测中得到推广。

3.2 PCR线性探针分析

关于幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的PCR线性探针检测的主要步骤：首先，对引物采用生物素进行标记；其次，通过PCR技术对目的基因序列进行扩增进而达到生物素化的扩增产物，也就是所谓的探针已经标记的待测核酸，然后将其与在NC膜上固定的未标记的特殊寡聚核苷酸探针进行杂交处理；最后，采用放射自显影技术对NC膜上是否存在互补的核酸分子进行判断。采用PCR线性探针分析方法对石蜡包埋的胃黏膜标本进行检测的灵敏度和特异度较高，因此该技术对于大环内酯类药物耐药性的检测可信度较高[9]。但是，目前受到探针的限制，该方法只能有效检测到7种突变基因。

3.3 肽核酸-荧光原位杂交

采用肽核酸-荧光原位杂交对幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性进行检测的主要原理：首先，对DNA探针采用已经特殊修饰的核苷酸分子进行标记，并将其与完整细胞内的目标序列开展原位杂交；其次，采用将探针分子与荧光素分子耦联的单克隆抗体开展特异性结合；最后，通过荧光显微镜对荧光探针互补的核酸序列进行检测[10]。相对于PCR线性探针分析技术来说，肽核酸-荧光原位杂交技术不需要大量的待测核酸，并且检测更快速，检测结果更精确。同时，肽核酸-荧光原位杂交技术由于采用的是PNA探针，因此DNA探针能较好地与目标基因进行杂交，并且不存在静电排斥问题[11]。但是该方法具有一定的侵入性，不适用于老年人及儿童。

3.4 聚合酶链式反应-限制性片段长度分析技术

采用聚合酶链式反应-限制性片段长度分析技术对幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性进行检测的主要原理：首先，采用PCR技术对目的基因进行扩增处理；其次，对扩增产物采用特异性限制性内切酶进行酶切，对酶切产物开展电泳迁移率变动分析；最终，观察电泳图谱对是否存在变异性进行判断[12]。该技术具有较高的检测特异度和灵敏度，在临床幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检验中被广泛应用。

3.5 3’错配聚合酶链式反应

3’错配聚合酶链式反应技术检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的基本原理：采用Cla18及Cla3等特异性引物在PCR扩增反应中进行反应，如果发生3’末端错配容易导致扩增产物的降低，产生片段基因，进而对突变型及野生型进行区分[13]。采用3’错配聚合酶链式反应技术可以对HP 23S rRNA A2142C位点突变进行有效检测。从整体上来说，3’错配聚合酶链式反应技术相比聚合酶链式反应-限制性片段长度分析技术具有更高的检测特异度和灵敏度[14]。

3.6 DNA测序技术

DNA测序技术是目前分子生物学检测方法中的金标准，可对幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性进行有效检测。该技术的优势在于检测过程更为直接，检测结果更为准确，可同时开展多耐药突变的检测[15]。但是，该技术仪器设备较为昂贵，通过在检测过程中容易出现模板浓度不当以及引物设计不合理的情况。目前，临床主要应用该技术来对其他检测方法的可靠性进行验证，以及用来发现新的其他未知突变。

4 小结

近年来，由于幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的不断增强，导致克拉霉素治疗效果逐渐下降。因此，开展幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药情况对于制定更积极有效的治疗方案具有重要意义。目前，关于幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性检测有一系列分子生物学检测方法，虽然部分分子生物学检测方法由于费用昂贵等原因尚未在临床检测中得到推广应用，但随着后续研究的不断深入，分子生物学检测将会在幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测中取得更为显著的效果。