糖尿病小鼠的周围神经病变检测*

赵钺沁 杨丽芬 周怡昆

(1. 昆明理工大学医学院，昆明 650504)(2. 云南省第一人民医院 昆明理工大学附属医院 内分泌代谢科，昆明 650032)

糖尿病周围神经病变(DPN)是以持续高血糖为特征的代谢紊乱而损害周围神经系统的疾病，是最常见的糖尿病慢性并发症之一[1-3]。其危害性远高于糖尿病本身，高达50%的糖尿病患者深受其害，病情严重甚至会致残致死[4-5]。由于DPN发病机制不明，尚缺乏特异性病因治疗方法[6-7]。

人体和动物在糖尿病前期就可能并发周围神经病变[8]。啮齿动物模型在糖尿病有关研究中应用普遍，DPN动物模型则是糖尿病动物模型随病情进展而成。由于技术的进步，价格低廉、生长周期短且容易操作的小鼠逐渐成为研究DPN发生发展并评估潜在疗法的重要工具，但相应的诊断方法尚无通用标准。目前，关于糖尿病小鼠神经病变的实验性文章较多，但鲜见描述检测神经病变方法的文献。本文针对糖尿病小鼠模型和相关的神经病变检测方法进行论述，旨在为进行糖尿病小鼠神经病变研究的科研人员提供参考。

1 糖尿病小鼠模型

糖尿病常见类型包括以胰岛素缺乏为特征的1型糖尿病和以胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病，神经病变多发于1型和2型糖尿病[9-10]。1型糖尿病患者常见小纤维损伤，而2型糖尿病患者常见大纤维损伤。一直以来，糖尿病动物模型首选大鼠，但近年来小鼠的使用也越加广泛。临床上，虽然2型糖尿病患者居多，基础研究却多见于1型糖尿病小鼠模型。不过，两种类型的糖尿病小鼠模型神经病变症状相似，如神经传导速度减慢、热痛过敏等[11]。然而，同一糖尿病类型的小鼠也会因品系、性别、造模方法的不同而出现疾病进程和症状差异。

糖尿病小鼠模型来源多样，如自发性模型、药物造模、转基因技术等。自发性糖尿病小鼠模型(如NOD小鼠、ob/ob小鼠等)和转基因模型的使用受到成本限制。而药物诱导形成的糖尿病小鼠模型经济实惠、操作简便，是研究糖尿病及其并发症的重要载体。糖尿病造模的常用药物为四氧嘧啶(ALX)和链脲佐菌素(STZ)，其机理都是选择性破坏胰岛β细胞扰乱机体代谢从而引发持续性高血糖。ALX建立的模型稳定性差、模型死亡率高。相较之下，作用温和、毒性小且模型存活率高的STZ使用更为广泛[12]。STZ可以快速有效地诱发小鼠糖尿病，但单一的STZ注射诱导的模型与人类1型糖尿病病理特征和临床症状更为相似[13]。高脂饮食是建立胰岛素抵抗和肥胖的常见方法，联合STZ使用能够复制出符合2型糖尿病特点的小鼠模型[14-15]。但是，STZ的药效有较大的批间差异，使用STZ需要设计完整合理的实验并谨慎操作以保证其药效的发挥，从而降低糖尿病小鼠的成模率、存活时长、胰岛细胞损害以及神经病变进展的差异性。

2 感觉功能检查

目前，普遍认为糖尿病性神经疼痛是周围神经病变造成的，尤其糖尿病动物模型的神经病变主要特征是周围神经功能受损[6]。研究显示，少数糖尿病患者和部分DPN患者有疼痛症状[1]。人类糖尿病初期一般呈现痛觉过敏，到DPN临床期发展为痛觉减退[6]。糖尿病小鼠也有类似现象，并且出现痛觉减退的速度更快[10-11]。糖尿病患者痛觉异常可能与大的有髓鞘A-纤维和小的无髓鞘C-纤维损害有关[16]。但由于糖尿病不同阶段的神经病变程度不同，患者感觉过敏或减退的潜在机制尚不明确。糖尿病早期，针刺、温度等不引起疼痛的正常刺激都可能诱发患者感觉异常，糖尿病小鼠也有相似情况。糖尿病小鼠感觉功能的评价方法多种，最常用的是触觉和温度觉的检查。

2.1 触觉检查

触觉检查是基于对轻触觉敏感的大的有髓鞘Aβ-纤维和对疼痛感知有关的小的无髓鞘C-纤维的检查。糖尿病动物模型呈现强烈的触觉异常疼痛，类似人类糖尿病患者常抱怨的触压不适[3, 17]。糖尿病小鼠发病后2～4周对Von Frey探针刺激的敏感性增加，到后期敏感性逐渐降低[18]。Von Frey法类似于临床常用的Semmes Weinstein单丝检查[19]，通过糖尿病小鼠的机械刺激敏感度评估触觉状态。手动Von Frey法以探针配合凿孔工作台，垂直刺激小鼠的足底。通过改变探针的粗细或伸出长度调整刺激力度，记录小鼠出现缩足反射的时间(即潜伏期)和刺激力度(即阈值)[20-21]。潜伏期较短为机械性痛觉过敏，潜伏期延长即为机械痛觉减退。电子von Frey触痛仪也能获得相似结果且检测快速、不受探针尺寸的限制[22]，但是尚不清楚与手动Von Frey法所测参数是否一致[11]。手动Von Frey法虽然有效合理，但是精确性不足且操作费时[23]，电子von Frey触痛仪可能会成为触觉检测的主要工具。

2.2 温度觉检查

糖尿病患者周围神经病变临床特征明显之前就已出现温度觉异常。STZ-大鼠诱发糖尿病后1～3周即表现出热痛过敏[24]，而小鼠多观察到热痛减退[11]。虽然温度觉异常与糖尿病患者的慢性疼痛无关，但轻度DPN患者普遍伴有该症状。而且，当患者神经病变症状显著时，周围神经多半已发生不可逆的病理改变。因此，检查机体对温度刺激的反应对DPN早期诊断意义重大。常用的糖尿病小鼠温度觉检查方法有四种：①甩尾法，将热源施加于小鼠尾尖，其尾巴从一侧转移至另一侧的时间即为潜伏期[6]；②Hargreaves法，与甩尾实验相似，唯一的不同是热源施加在后爪，观察小鼠后爪抬起的时间[8, 20]；③热板法，先校准热板(50±5)℃，使正常小鼠在10 s内发生缩足反射。然后，将糖尿病小鼠放至热板，记录其暴露于热板产生舔足、缩足等反射的时间[4, 6]；④冷板法，与热板法的差异在于温度，冷板温度一般在4 ℃左右，有人认为最佳温度为5 ℃[6, 25]。虽然糖尿病患者神经损伤时存在冷、热觉异常，但热刺激比冷刺激更具优势。伤害性热阈值的测定多用甩尾法和热板法，而热板能精确设置多种温度环境且小鼠能自由活动，减少了干扰和误差。因此，多采用热板法判断糖尿病小鼠的温度觉损害。不过，快速和慢速的温度感觉传导分别由Aδ-纤维和C-纤维负责，单一的温度感知实验不能完全诠释温度觉异常，因此多种方法联用可能更具参考价值。

3 神经电生理

神经传导速度(NCV)减慢是糖尿病患者早期神经功能紊乱的特征之一[26]，糖尿病动物NCV也有不同幅度的降低[27]。神经电生理是通过NCV诊断周围神经病变的金标准，也是DPN检查的重要手段[28]。NCV检查包括三种方法[29]：①体内直接检测，将经药物麻醉的糖尿病小鼠固定，刺激电极插入其后肢坐骨神经切口，在同侧坐骨神经处的踝关节插入记录电极，并将参考电极置于刺激和记录电极之间，通过脉冲波刺激神经，记录小鼠产生的复合动作电位[4, 30]；②体内间接检测，与体内直接检测的不同在于，记录和刺激电极均作刺激电极，并将记录电极置于小鼠脚趾第一骨间肌肉处[29]；③离体直接检测，解剖小鼠分离坐骨神经。刺激电极置于坐骨神经结节处，记录电极置于踝关节处，参考电极位于其他两种电极之间[31]。

神经传导速度(NCV)检测广泛用于疾病诊断和动物实验，促使该法在糖尿病小鼠神经病变研究中得以推广。糖尿病小鼠发病后可见NCV异常[32]，并且发生神经传导功能障碍的速度很快。随着糖尿病小鼠存活时间延长还呈现轻微的结构异常，这可能是糖尿病患者神经病变显著的前兆[17]。然而，DPN早期多累及小纤维神经，甚至早于大纤维受损或电生理证据。NCV只能反映大神经纤维的功能状态，对小神经纤维及无髓鞘神经纤维的病变不敏感，这也造成了 DPN 临床检出率偏低[9]。所以，单纯的神经传导功能完好难以排除DPN的存在。而且，DPN是动态的进行性疾病且多发于急性代谢紊乱期，多种神经功能损伤都是可逆的，并且人体与动物NCV异常的发生机制可能不同，因此糖尿病小鼠NCV检测的参考价值还有待商榷。

4 病理学检查

DPN发病率高且起病隐匿，其病理变化与临床表现往往不一致。进行性结构异常是DPN患者的主要病理学特征如轴突变性，引发多种临床体征和症状如疼痛、麻木和感觉异常[1, 9]。DPN发展涉及神经元、雪旺细胞和神经纤维的丧失或退化等[17]，糖尿病小鼠的神经病变研究也有类似发现。病理学检查是评价DPN病情的标准之一，坐骨神经、足部皮肤和背根神经节(DRG)是研究糖尿病小鼠神经病变病理改变的常用样本。

正常的坐骨神经有髓神经纤维髓鞘均匀密集、结构完整、排列规则而层次分明，且轴索功能完好、神经丝丰富，神经内膜结构正常。糖尿病小鼠随着病情发展，坐骨神经逐渐出现组织学损伤如有髓神经纤维分布稀疏、神经内膜水肿和轴突变性等，甚至某些神经肽物质如P物质水平显着下降[33]。通过HE染色、甲苯胺蓝染色等便可观察坐骨神经的病理变化[34-35]，但很难明确定量有结节区域的神经纤维变化。

泛神经元标记物PGP 9.5为神经元和神经纤维特异性标记蛋白，能够诊断小神经纤维损伤，其免疫反应显示糖尿病患者神经纤维明显变薄[36]。对足底皮肤的检测常用PGP 9.5抗体来实现表皮神经纤维(IENF)的可视化和定量检查[20]。人类IENF密度降低与振动觉等神经功能障碍及神经病变程度相关。在糖尿病小鼠发病后2～8周也可见IENF显著减少， IENF丢失可能是DPN早期指标[33, 37]。有人提出IENF损失造成热觉丧失，但IENF的完整性与痛觉异常的一致性，还有待验证[33]。

DRG是痛觉传入的初级神经元，影响着不同形式感觉(痛觉/温觉/触觉)的传递。DRG神经元异常可能是糖尿病患者并发DPN的原因。糖尿病小鼠神经病变早期，DRG便有神经元细胞损伤，并随病程延长而加重[38]。诸多糖尿病性神经病变实验也显示糖尿病小鼠的DRG部分细胞凋亡和神经元丢失[39]，可能与痛觉减退有关。TdT原位细胞凋亡法、HE染色等能够检测DRG神经元细胞的改变[40]。此外，转录激活因子3(ATF3)是神经损伤的神经元标记物，现已广泛作为DRG受损的指标，可以通过免疫染色检查其表达情况，进而评价初级感觉传入纤维的应激水平[41-42]。

5 运动功能检查

DPN患者早期并无明显运动缺陷[43]，运动障碍多数在疾病后期出现甚至伴有严重病态包括足部或脚踝骨折易感性、足溃疡和截肢，引起步态异常和肢体不协调[19, 44-45]。糖尿病小鼠运动功能检查常用方法有步行轨迹法、斜坡试验和转棒试验三种。

坐骨神经功能指数(SFI)是评估周围神经功能的常用参数，经药物治疗后糖尿病大鼠的SFI改善明显[46]。步行轨迹法基于动物足迹来获取SFI进而评估坐骨神经功能，以不同颜色的液体对糖尿病小鼠前后爪着色，将其放在铺有固定尺寸的白纸的行走箱中自由行走[46]。测得小鼠脚趾展开度、脚趾间距离、足迹长度等步态参数通过Bain公式来计算SFI了解其神经功能状态[47]。该法操作简单，但依赖于有色液体和纸张获得足迹，易产生伪足迹、变形足迹，难以获得精确数据和动态步态信息。Fricker等自制一套SFI红外线评估系统，通过红外装置和相机捕捉动物的足迹。该系统价格低廉还能使SFI数字化，并提供糖尿病鼠的动态足迹，降低实验重复次数与实验动物使用量[48]。不过，这一仪器尚未普及，实验效果有待考查。

斜坡运动是通过小鼠在一定角度的斜坡上保持平衡的时间来研究四肢运动神经损伤程度和治疗时期的体位维持能力的方法。设计一定尺寸的玻璃水槽，在其内部铺盖粗糙橡胶垫。将糖尿病小鼠置于水槽中间，其身体轴线垂直于橡胶垫斜坡3～5 min，使之适应环境。然后，匀速调整橡胶板来改变斜坡角度，记录小鼠滑动2 cm和保持体位5 s的最大倾斜角度，从而评价小鼠的运动协调能力[49]。

Heyser等曾用转棒试验检测可卡因对小鼠运动能力的影响[50]。糖尿病小鼠的转棒试验表现正常，表明其无运动缺陷[11]。转棒试验是检测糖尿病小鼠肢体协调运动最常用的方法[45]。转棒是悬挂于基座的系列圆杆，正常小鼠在圆杆上转动数分钟，而糖尿病小鼠神经病变后可能出现协调能力缺陷，容易从圆杆跌落，小鼠的跌落时间可以评价其神经病变的严重程度。

6 角膜观察

角膜共聚焦显微镜观察角膜神经状态是诊断糖尿病患者早期周围神经病变的非侵入性手段[51]。由于角膜神经与下肢神经功能、其他神经功能检测结果的相关性还存在争议，角膜神经的改变尚不能作为DPN的可靠指标[52]。但是，临床发现糖尿病患者角膜损伤随病程发展而加重[53]，动物实验也显示角膜神经损失速度与糖尿病的严重程度有关[20]。近年来研究显示，糖尿病小鼠的上皮下角膜神经显著减少[8, 20]。角膜共聚焦显微镜还可以跟踪观察小鼠角膜神经的进行性消耗，未来可能成为定量诊断糖尿病周围神经病变的一种高敏感性、高重复性且非侵入性方法。

7 总结

糖尿病小鼠在糖尿病发病后2～8周就有类似人体DPN的早期症状如感觉过敏或减退、IENF丢失等，并且其繁殖周期短、价格适宜、操作方便，这使其成为DPN研究的重要工具。但是，在DPN研究中任何小鼠模型的大小都是难以避免的缺点(如足部面积小使得触觉检查不易进行)，这可能妨碍实验数据的准确采集。并且，小鼠寿命也限制了我们研究DPN的长期变化[3]。此外，由于STZ-小鼠在无干预措施的情况下，也可能恢复正常的血糖水平，我们还需密切监测小鼠血糖水平的波动。

关于糖尿病小鼠DPN的筛查方法很多，但暂无统一标准，感觉、神经电生理和病理学检查是最基本的方法。感觉检查简单可靠且敏感性较高，但该法基于小鼠机体不适的指标如舔足、缩足等，这些行为存在个体主观性，与刺激强度、疼痛感知不完全相关。神经电生理法具有良好的重复性、客观性，但无法评估小神经纤维损伤且操作费时。病理学检查可以评估多种纤维类型包括其他方法难以评估的小的无髓纤维，是量化小神经纤维病变可靠且可重复的方法，能够弥补感觉和电生理检查的不足。不过要获得准确的病理学诊断, 需要保证取样准确性。运动学检查的参考价值不如其他方法，多作为辅助手段来排除运动缺陷造成小鼠在其他实验中表现欠佳。糖尿病小鼠周围神经病变的检查方法各有利弊，因此在实际应用中，多种方法联合应用对我们深入探究DPN的发生发展具有重要意义。