树鼩的标准化研究与应用进展*

王文广 匡德宣 仝品芬 李 娜 陆彩霞 罕园园 孙晓梅 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室、云南省眼科疾病防治研究重点实验室、中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队, 昆明 650118)

树鼩(TupaiaBelangeris， Tree Shrew)是一种形似松鼠、吻部较长的小型哺乳动物，目前在分类学上属于攀鼩目，介于灵长目与食虫目之间。树鼩主要分布于南亚、东南亚及我国南部如云南、贵州、广西、广东、海南等省区，其中应用最为广泛的是中缅树鼩滇西亚种。树鼩与灵长类动物的进化关系比啮齿类动物更接近，在生命科学研究领域有很大的应用潜力，世界卫生组织在20世纪90年代就建议用树鼩代替大型灵长类动物进行科学实验。

早期研究中使用的树鼩大多来自野外，它们的遗传背景不清，健康状况未知，且个体差异较大，不利于科学研究的顺利进行，因此需要大力开展树鼩的标准化建设。我国从20世纪70-80年代就开始了树鼩人工驯养繁殖研究，研究力量主要集中在昆明，如中国科学院昆明动物研究所、中国医学科学院医学生物学研究所和昆明医科大学等科研院校。在国家和地方科技项目的不断大力支持下，科研人员对树鼩的标准化建设工作进行了系统性研究，并取得了突破性成果。

1 树鼩的主要生物学特性

1.1 树鼩的体型特征

树鼩形似松鼠，但吻部较长，耳朵较短，尾毛发达向两侧分散。成年树鼩一般体长14～19 cm，体质量120～180 g。前后足均有五趾，每趾都有尖爪。犬齿细小，前臼齿宽大。头骨的眶后突发达，形成一骨质眼球，脑室较大。体毛粟黄色，颌下及腹部为浅灰色。

1.2 树鼩的野外习性

野生树鼩多在丘陵、平原近农舍旁的灌木丘林里活动，在土丘中挖洞作穴，亦有在树上筑巢，雌雄成对生活，不群居。常见单个出没于丛林或村落，行动灵活，善于攀缘。树鼩是杂食性动物，常以昆虫、小鸟、五谷野果为食，更喜甜食如蜂蜜。

1.3 树鼩的笼养特性

树鼩常在笼内作翻滚窜跳活动，以黎明和黄昏时最为活跃。树鼩好动能耗大，饲料中应有足够的蛋白质，并搭配合适的水果，以保证营养。两雄好斗，不宜同笼，宜将雌雄树鼩1∶1配对。树鼩生性胆小，易受惊，如长时间处于应激状态时，会导致采食量下降、生长受阻、繁育率下降等。因此，笼养时应注意控制噪声，温度维持在20～28 ℃为宜，湿度应控制在40%～70%之间。

1.4 树鼩的繁育特性

树鼩性成熟时间约为6个月，怀孕期42 d左右，每胎产仔2～4只，每年3-8月为生殖季节。母树鼩怀孕后应尽早分笼单养，保证温和的孕育环境，受刺激后易流产或产后食仔和拒养。子树鼩初生时体质量约10 g，头身长(6.4±0.4) cm，尾长(3.8±0.29) cm，全身无毛，皮肤粉红，眼闭，只会蠕动，5～6 d皮肤变黑，开始长毛，14～21 d开眼，3周开始走动，4周可跳动，5～6周断奶而独立生活。

2 树鼩的标准化研究

树鼩的标准化工作一直是在国家实验动物资源发展规划的战略指导下有序推进的，持续受到科技部科技支撑计划项目和云南省科技基础条件平台计划项目的大力支持，尤其是在国家科技支撑计划项目“实验用树鼩的标准化研究和人类重大疾病树鼩模型创建与应用集成示范”顺利实施后，树鼩种质资源基地建设已经完成，树鼩质量技术体系日趋完善，树鼩团体标准也得以颁布实施，其标准化研究水平得到空前提高。

树鼩标准的制定是推动树鼩实验动物化的有力保证，早在2010年11月云南省就发布了地方标准《实验树鼩(DB53/T328.1-328.5-2010)》，并于2011 年3月1日正式实施，主要由昆明医科大学制定，其内容共分为5个部分：1. 实验树鼩(第1部分)：微生物学等级及检测(DB53/T 328.1); 2. 实验树鼩(第2部分)：寄生虫学等级及检测(DB53/T 328.2); 3. 实验树鼩(第3部分)：遗传学质量控制(DB53/T 328.3); 4.实验树鼩(第4部分)：配合饲料(DB53/T 328.4); 5.实验树鼩(第5部分)：环境及设施(DB53/T 328.5)。2012年5月又发布了由中国医学科学院医学生物学研究所和昆明理工大学制定的实验树鼩云南省地方标准第6～10部分，即饲养管理、生物学特性数据测定、实验基本操作技术、HCV病毒感染树鼩原代肝细胞模型制作和 HCV病毒感染树鼩模型制作。云南省树鼩地方标准的颁布填补了当时我国实验树鼩无质量标准的空白，为树鼩人工繁殖和实验研究提供了有力的技术支持。

近年来，随着大量实验数据的积累，人们也不断地对树鼩的地方标准进行修订和完善，并努力向着应用范围更广的树鼩国家标准靠近，由中国医学科学院医学生物学研究所制定的6项树鼩团体标准于2017年5月获得全国实验动物标准化委员会颁布，分别是(1)T/CALAS 08-2017 实验动物 树鼩微生物学等级及监测；(2)T/CALAS 09-2017 实验动物 树鼩寄生虫学等级及监测；(3)T/CALAS 10-2017 实验动物 树鼩环境与设施；(4)T/CALAS 11-2017 实验动物 树鼩遗传质量控制；(5)T/CALAS 12-2017 实验动物 树鼩配合饲料；(6)T/CALAS 13-2017 实验动物 树鼩病理学诊断规范。该团体标准的颁布实施，为树鼩作为实验动物的标准化提供更科学的技术支持，并有力推动了树鼩在全国范围的推广和应用。

3 实验用树鼩的应用研究

3.1 感染性疾病模型的研究

先后有人甲肝、乙肝、丙肝和丁肝病毒感染树鼩，均在树鼩体内发现病毒复制，并观察到一定的临床症状，其中以乙肝病毒和丙肝病毒模型研究成果较为突出。 Glebe等发现HBV 可有效感染成年树鼩原代肝细胞，证明pre-S1结构域是树鼩肝细胞感染HBV必需的抗原，这一点与HBV感染人肝细胞的方式相似[1]。Yan等以人类HBV感染树鼩原代肝细胞模型为基础，成功证明了灵长类动物的钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白为HBV 感染肝细胞的特异性受体[2]。谢春志等[3]、冯悦[4]通过含HCV的人血清感染树鼩，均发现树鼩可感染人HCV。Barth等[5]研究发现树鼩肝细胞上I型清道夫受体、CD81分子在HCV包膜粘合到树鼩肝细胞中起了重要作用。随后，Tong等[6]报道了树鼩CD81分子、SR-BI分子和Claudin-1分子可介导HCV感染。就目前的研究资料看，除人和黑猩猩外，树鼩是经证实能感染人乙、丙型肝炎病毒的小型哺乳类动物，可以弥补其他动物如啮齿类动物和禽类动物病毒性肝炎模型的不足。

流感病毒亦可感染树鼩，研究发现H1N1流感病毒可能在树鼩的上呼吸道复制，使其表现出轻微或中度的呼吸道症状及呼吸道的病理变化，发现广泛分布于气管和鼻黏膜的受体是sialic acid (SA)a2，6-gal，而肺组织中的主要受体是(SA)a2，3-gal[7]。

树鼩还有望成为手足口病动物模型，王文广等[8]对3个月龄的树鼩进行EV71感染实验，发现其体温、白细胞和淋巴细胞水平均有升高趋势；感染后2周，部分树鼩表现出急性松弛性瘫痪症状，并伴有尿潴留，组织病理学检查在脑、心、肺、脾、肾等部位发现相应的病理变化，表明EV71 病毒可感染幼龄树鼩。Li等[9]用CA16 感染树鼩后，在其多种器官以及中枢神经系统和粪便中发现高载量病毒，同时肺、肾等组织中也出现细胞损伤和炎性细胞侵润等病理反应，说明树鼩对CA16 具有敏感性，适合发展为研究CA16的潜在动物模型。

另外，人们还发现登革病毒[10]、HSV病毒[11]、EB病毒[12]可感染树鼩，可用来建立感染模型开展研究。

3.2 神经系统疾病模型

何保丽等[13]用β-淀粉样蛋白(Aβ)侧脑室注射建立树鼩老年痴呆模型，从模型制作后第8天开始，治疗组树鼩连续30 d灌胃给予天麻素，通过RT-PCR检测海马脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达，结果显示天麻素能在一定程度上上调树鼩海马BDNF的表达。

Ma等[14]对树鼩连续腹腔注射MPTP[3 mg/(kg·d-1)]，5 d后出现典型的帕金森运动症状，且纹状体DA和DOPA水平显著降低，脑中α-synuclein mRNA水平升高，提示树鼩可能是研究PD 发病机制的潜在动物模型。邓苙等[15]的研究指出树鼩MPTP模型与6-OHDA模型相比，PD 行为学特征更明显，树鼩的TH阳性神经细胞呈双侧性减少，提示MPTP 经腹腔注射是制备树鼩PD 模型的理想方法。

有学者注射不同剂量吗啡到树鼩体内以研究其耐受性和依赖性，注射吗啡后同时使用纳洛酮(1.25 mg/kg体质量)，发现树鼩出现诱导条件性位置厌恶和戒断症状[16]。Shen等[17]使用树鼩开展吗啡成瘾性研究，结果显示肌肉注射吗啡(5或10 mg/kg)30～60 min后树鼩的运动活性显著增加；条件性位置偏爱/厌恶实验结果显示，树鼩偏爱有吗啡的盒子，而纳洛酮诱导条件性位置厌恶；以上研究表明树鼩可以成为成瘾行为和神经机制研究的候选者。

Meng等[18]利用树鼩先后建立了社交挫败模型、习得性无助模型及慢性温和应激模型，通过药物抗抑郁实验发现，氯丙咪嗪能够逆转抑郁动物的社交退缩行为，氟西汀对习得性无助行为具有翻转作用，而卡贝缩宫素则对兴趣下降、社交退缩及习得性无助行为均具有显著的治疗效果[19]。

3.3 眼科疾病模型研究

树鼩眼球解剖及视觉系统与人类有高度相似性，感光细胞以视锥细胞为主，对形觉剥夺环境极为敏感，是研究形觉剥夺性近视的极佳动物模型。Siegwart和Norton[20]将自然睁眼后7 d、15 d、21 d、33 d、48 d、63 d树鼩分别用半透明遮光板单眼剥夺12 d观察眼轴的延长，发现树鼩近视的易感期的高峰时段大约发生在睁眼后15～45 d之间。周广龙等[21]通过单眼形觉剥夺建立树鼩弱视模型，发现形觉剥夺引起的神经元损伤具有可恢复性，C-fos基因和蛋白可能参与了形觉剥夺视皮质神经元的损伤及可塑性，结果显示树鼩有潜力成为良好的形觉剥夺弱视模型。

李妍等[22]采用基质注射茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型，并发现促炎因子IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10在树鼬茄病镰刀菌性角膜炎炎症反应机制中发挥重要作用。Samuels 等[23]向成年树鼩眼睛前房中注射25 mg/mL的磁珠溶液，从而诱发青光眼，视网膜神经纤维层(RNFL)显著减少，视神经表现出与青光眼性视神经病变相一致的组织病理学变化。

3.4 代谢疾病模型研究

Li等[24]采用高糖脂肪饮食与地塞米松联合诱发了树鼩2型糖尿病。Wu等[25]使用不同剂量的STZ (60、70和80 mg/kg)也建立了类似的2型糖尿病树鼩模型。此外，有人通过高糖高脂肪饮食和4次STZ 注射成功建立了糖尿病肾病树鼩模型，并通过实验证明骨髓移植也可以提高胰岛素抵抗性[26]。

Xing等配置不同浓度的食用酒精溶液供树鼩饮用，2周后引发酒精代谢酶改变和脂肪肝样病理改变[27]，而Meng等人发现罗格列酮可以预防树鼩的脂肪肝发育[28]。Zhang等[29]使用高脂肪、胆固醇和胆酸盐饮食，成功地在树鼩中诱发了非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，发现Poloxamer 407对脂蛋白脂肪酶的抑制改善了脂肪病的严重程度，减轻了炎症，与小鼠脂肪肝病模型相比，树鼩模型发病时间较短且症状更为明显。

3.5 树鼩细胞的开发和应用

树鼩细胞也是树鼩资源的有机组成部分，同时也是重要的体外实验平台，目前文献报道已经成功分离培养的有树鼩肺成纤维细胞[30]、脊髓星形胶质细胞[31]、胸主动脉血管内皮细胞[32]、小肠上皮细胞[33]、角膜内皮细胞[34]、骨髓间充质干细胞[35]和脐带间充质干细胞等[36]。其中比较有示范性的应用是干细胞治疗，在国家科技支撑计划项目(2014BAI01B00)支持下，解放军昆明总医院已建立树鼩脐带和骨髓间充质干细胞体外分离、培养、扩增和鉴定技术体系及规范，建成可储存10 000份的干细胞种子资源库，制备储存树鼩脐带和骨髓间充质干细胞2 000份；建立了树鼩脐带和骨髓间充质干细胞体外转GFP基因标记、BrdU标记、DAPI标记和顺磁标记，为研究间充质干细胞在体内的生物学行为提供了分析测试方法；以树鼩代谢综合征[37]、糖尿病[38]、系统性红斑狼疮模型[39]为研究对象，进行了树鼩脐带间充质干细胞的疗效评价，为干细胞临床疗法提供了技术参考。

4 树鼩标准化研究的意义与展望

树鼩是我国特色动物资源，开展树鼩的实验动物化和种质资源保存是一项国家战略性任务，而建立标准化和规模化的树鼩种质资源基地，是实现其质量标准化、生产规模化、供应商品化和服务社会化的根本前提，具有重要应用价值和战略意义。建立标准化树鼩种质资源，可有力促进其在生命科学领域的推广应用，可为探讨人类疾病致病机制和开发新型治疗药物等提供良好的实验动物模型，满足生命科学和医药产业发展的需求，促成相关科学研究的重大突破。树鼩种质资源基地的建立及标准化研究技术体系和成果，可为我国其他实验动物新品种的研发、保存和共享提供借鉴，共同促进我国实验动物种质资源保存工作的专业化和系统化。

未来树鼩的标准化建设，要在地方树鼩种质资源基地的基础上，逐步提升其规模化和标准化水平，不断完善树鼩标准并制定其国家标准，力争建成国家级树鼩种质资源中心，同时积极开发适用于树鼩实验的检测技术体系和试剂盒，加快推进树鼩细胞资源库的建设和转基因树鼩的研究。