中药对阿尔兹海默症APP/PS1转基因小鼠的治疗作用研究进展*

徐慧琳 范 震 冯成强

(北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室,北京师范大学天然药物教育部工程研究中心，北京 100875)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s diease，AD)，又称老年痴呆，是慢性的中枢神经系统退行性疾病，两大主要病理特征为脑中β-淀粉样蛋白 (bate amyloid protein，Aβ) 沉积成斑块 (senile plaques，SP) 和tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，并伴随着神经元突触缺失，中枢神经系统炎症、氧化应激反应等特征[1]。患者临床表现为脑萎缩、认知能力减退、记忆力下降、生活不能自理，最后死亡。随着人口老龄化加剧，AD发病率不断上升，严重危害老年人身体健康，已经成为神经医学亟需解决的难题。

1 APP/PS1转基因小鼠模型的特点

APP/PS1 转基因模型是小鼠体内表达突变的β淀粉样蛋白前体swe 基因(β-amyloid precursor protein swe，APP swe) 和人类早老素1基因(presenilin 1246E，PS1246E)[2]。β淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)经β裂解酶、γ分泌酶水解生成Aβ，而突变的APP基因会加剧Aβ的沉积。该模型鼠能较早地表现出AD症状，其在4月龄时大脑皮层和海马体中便出现了老年斑，在6～8月龄时能观察到明显老年斑的形成，在12月龄时斑块沉积进一步增加[3]。除此之外该小鼠还具有tau蛋白过度磷酸化、小胶质细胞和星形胶质细胞过度活化、中枢神经系统炎症反应、神经元结构改变、突触缺失及认知功能障碍等方面的表型特点，与AD患者有着较高的一致性，是国内外防治AD药物筛选常用的动物模型，近年来该模型已广泛应用到中医药防治AD的研究领域。

2 中药对APP/PS1转基因小鼠的治疗作用

2.1 与Aβ斑块相关的作用

2.1.1减少Aβ斑块沉积：Aβ在脑中过度积累形成斑块，具有神经毒性，能够产生级联反应，加剧AD。这种神经毒性作用，属于中医“毒”的范畴，其中医病理机制为“毒损脑络”。故很多清热解毒的中药被应用于降低Aβ的研究。如出自唐代王焘《外台秘要》的黄连解毒汤，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味苦寒药物制成，是清热解毒的经典方剂，冯佩用高、中、低三个剂量的黄连解毒汤给3月龄小鼠连续灌胃6个月，并用RT-PCR检测脑中β-淀粉样前体蛋白基因表达量，发现各剂量的黄连解毒汤均能降低模型小鼠脑内β-APP基因表达水平，其中中剂量组(433 mg/kg·d-1)效果显著优于西药安理申对照组[4]。而杨文育等通过western blot和硫磺素 T 染色发现具有清心解毒、凉血开窍功效的清心开窍方能够促进APP/PS1双转基因小鼠海马区AKT的表达， 并减少Aβ、GSK3α、βAPP的表达， 减少APP/PS1双转基因小鼠脑内皮质及海马区的老年斑数量[5]，其中GSK3α是GSK3的亚型，是γ分泌酶的关键激活剂，AKT 和 GSK3α 是 βAPP 和 Aβ 的上游调控蛋白，表达增加的AKT能使GSK3磷酸化，抑制其活化[6]，从而进一步抑制APP前体被分解为Aβ，降低其在脑中的含量。藏药七十味珍珠丸(ratanasampil，RNSP)能够改善大脑功能，具有安神、促进学习记忆的功效，闫清伟等通过给3月龄的APP/PS1小鼠连续灌胃12周，发现RNSP能够延缓小鼠脑萎缩的进程，减少脑内老年斑的沉积，降低脑内BACE1裂解酶的表达量和Aβ1-42水平，改善小鼠认知能力[7]。

2.1.2改善Aβ的毒性作用:Aβ的毒性作用主要包括：使脑中胶质细胞过度活化，炎症因子大量释放，诱发神经炎症；自由基及过氧化损伤导致的氧化应激反应；损伤神经元突触的传导功能，神经元结构变性等[8]。

2.1.2.1 抗炎症的作用：近年来越来越多的研究表明，AD 患者脑中持续存在着慢性炎症反应，表现为小胶质细胞和星形胶质细胞过度活化、炎症因子大量释放[9]。淫羊藿次苷Ⅱ(ICS Ⅱ)是淫羊藿的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌的作用，曾令荣等通过连续灌胃7个月的方法，发现ICS Ⅱ可显著降低APP/PS1双转基因小鼠海马组织中APP、Aβ1-42、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)蛋白表达水平，降低炎症因子COX-2、TNF-α蛋白表达水平，增加抗炎因子IL-10蛋白表达水平，其中Aβ与RAGE结合后可激活小胶质细胞加速炎症反应，因此ICS Ⅱ具有减轻APP/PS1小鼠炎症反应的作用[10]。姜黄素是从姜黄属中药姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取出的酚类色素，属活血药，具行气祛风、活血止痛之效，韩园等用含姜黄素的饲料持续喂养4月龄转基因小鼠5个月，发现该时期的给药组小鼠脑中尚未出现相关病理学和相应的行为学改变，说明口服姜黄素可以用于早期预防性治疗，改善转基因小鼠的学习和记忆能力，并下调海马中高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein-1，HMGB1)水平，减少其下游晚期糖基化终产物受体(receptor foradvanced glycationendproducts，RAGE)和Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)的表达，进而使下游核转录因子-κB(Bnuclear factor kappaB，NF-κB)表达量减少，抑制其调控的炎症信号转导通路，缓解了AD病症[11]。作为治风剂之首的小续命汤具有宣通玄府、开发郁结的功效，毛敬洁等研究发现小续命汤改善APP/PS1双转基因鼠的认知功能作用，减少其大脑海马区Aβ的沉积、抑制星形胶质细胞的过度活化[12]。

2.1.2.2 抗氧化应激的作用：AD患者和APP/PS1小鼠体内会发生氧化应激反应，即过氧化作用与抗氧化作用失衡， 导致自由基产生增多，氧化物超过体内的抗氧化能力，过多的自由基进一步造成神经组织和细胞损伤，加重AD。APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠脑内SOD活性明显降低，MDA含量明显增高，而用补肾化痰益智方给药干预后，其抗氧化作用和认知能力得到了显著的改善[13]。类叶升麻苷(Acteoside，AS) 是从肉苁蓉中提取出的一种苯乙醇苷类活性成分，肉苁蓉有延缓衰老、提高免疫力的功效，其降低 APP /PS1 双转基因小鼠的超氧化物歧化酶 SOD 抑制率，明显升高丙二醛MDA 含量以及提高谷胱甘肽二氧化氢酶GSH-Px 活性，改善脑源性神经营养因子(BDNF)匮乏状态，具有改善 AD 焦虑症状、提高学习记忆能力、延缓衰老、提高抗氧化能力等效用[13]。

2.1.2.3 神经元保护的作用：AD患者脑中会出现神经元突触缺失、神经元结构损伤等病症，严重阻碍了脑内神经信号传递，导致患者学习记忆能力减退，出现痴呆症状。故许多益智养心的中药复方被应用于AD的研究，如由远志、人参、茯苓、菖蒲制成的开心散， 始见于唐代孙思邈《备急千金要方》，是中医安神定志、益智养心的基础方剂，能促进APP/PS1转基因小鼠长时程增强LTP形成，增强突触可塑性，可能与调节突触后致密物PSD-95蛋白表达有关，其中，海马长时程增强是反映神经突触可塑性和在空间学习记忆过程中神经元的生理活动客观电生理指标；PSD是接受与传导突触信号的分子装置，PSD-95则是含量最丰富的脚手架蛋白，与突触信号传导密切相关[14]。具有开窍安神功效的洗心汤可以改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆功能，提高小鼠海马突触功能蛋白及受体表达，具有保护神经元突触的功能[15]。王健等的电镜结果显示，通过调心方灌胃治疗之后，转基因小鼠海马 CA1 区突触小泡、突触数量明显增加，突触结构、神经元结构能保持完整，突触功能得到保护，同时调心方具有多靶点、远期疗效更稳定的优势，且对 AD 患者有效[16]。

2.2 减少tau蛋白过度磷酸化的作用

Tau蛋白是分布在神经元内的微管相关蛋白，对维持细胞骨架完整性、突触间信号传递具有重要的作用，在AD患者脑中过度磷酸化，进而神经纤维缠结，导致细胞骨架异常及细胞死亡[17]。葛根素(puerarin，PU) 是从葛根中提取出的异黄酮类化合物，具有改善心肌收缩、降低心肌耗氧量、扩张冠脉和脑血管促进血液循环等作用，其能够改善APP/PS1小鼠的认知和记忆功能障碍，降低大脑皮层中 Aβ的水平，通过抑制GSK3β 信号通路活性，阻止 tau 蛋白过磷酸化[18]。

2.3 改善胆碱能系统的作用

六味地黄丸是传统滋补肾阴的经典名方，功效是滋补肾阴，填精补益现代药理学研究表明，六味地黄丸具有抗氧化，抗细胞凋亡等作用，六味地黄丸可提高转基因鼠脑内乙酰胆碱转移酶Ch AT活性，增加乙酰胆碱脂酶ACh含量，影响中枢神经胆碱能系统，进一步改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力[19]。

2.4 改善认知能力的作用

认知能力障碍是AD患者的常见病症。服用复方丹参片的APP/PS1小鼠，脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量增加，通过Morris水迷宫实验、高架十字迷宫实验和新奇抑制摄食实验等方法发现该药具有改善转基因小鼠的焦虑样行为和学习记忆损伤的功能[20]。

2.5 调节昼夜节律的作用

越来越多的证据显示，老年性痴呆和昼夜节律的紊乱密切相关，改善昼夜节律紊乱可以改善老年痴呆的认知障碍[21]。丁莉等研究发现生慧汤可以调节APP /PS1 小鼠Per1、Cry1、Clock、Bmall等节律基因 mRNA 的表达，可以改善 AD 模型小鼠的昼夜节律紊乱[22]，其中生慧汤是由熟地，山茱萸、远志、酸枣仁、去油柏子仁、茯神、人参、石菖蒲、白芥子组成的中药复方，具有益气养血，心肾兼补之功效，主治心肾不足，老年健忘。

3 总结与展望

目前，大量的研究结果表明，AD的发生与发展是多个因素综合作用的结果，其致病机制复杂且尚不明确，缺乏有效药物，而中药防治AD作为一个研究热点，能从抑制Aβ过表达、减少突触缺失、保护神经元、抗氧化应激反应、抗炎、抑制tau蛋白过度磷酸化、调节生物节律、抗衰老等多个方面改善APP/PS1小鼠病症，对于研究人类AD病理发挥着极为重要的作用。

在中医药防治AD研究中，实验动物模型的选择是至关重要的，而APP/PS1双转基因小鼠在病理、行为等多方面均与 AD 病人临床疾病的发展过程高度相似[23]，且积累老年斑块时间早，痴呆症状随着年龄增长而加剧[24]，大大地优于其他非转基因的动物模型。同时，该种小鼠模型Aβ表达量是同龄APP单转基因小鼠模型表达量的20～40倍[25]，能较早地表现出AD症状，便于根据实验目的灵活地选择研究月龄，即可选择患病早、中或晚期某一特定的时期进行研究，也可以进行动态持续性地长期观察。其给药方式多为灌胃，给药方法是设置不同浓度的中药，连续给药3周至7个月不等。在行为学研究方面，Morris水迷宫实验、高架十字迷宫实验和新奇抑制摄食实验等方法都能很好地应用于APP/PS1小鼠的认知能力的研究。常用的检测技术手段有免疫荧光法、免疫组化技术、western blot、RT-PCR、ELISA等方法，对小鼠脑中各种成分含量进行检测。

尽管APP/PS1小鼠在中药干预研究中有着广泛的应用，但是针对这一较先进的动物模型，中医界的研究尚不够系统、不够微观，还需要进一步从其细胞水平、分子水平、基因水平等各方面对AD的致病机制进行深入系统的研究。