菊花黄酮化合物组成、抗氧化活性及相关性分析

雷康藤，龙娟娟，杨琳妹，张毛毛，钮谷雨，张 培

(滁州学院 材料与化学工程学院，安徽 滁州 239000)

菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序，气清香，味甘、微苦。具有散风清热，平肝明目，清热解毒之功效。按照产地和加工方式的不同，具有“亳菊”、“滁菊”、“贡菊”、“杭菊”、“怀菊”等多种类型[1]。

黄酮类化合物是菊花的主要有效成分之一，具有广泛的药理活性，如抗氧化活性、抗肿瘤活性等[2]。目前，国内外对菊花的研究主要集中在黄酮类化合物的提取、含量测定及初步活性研究，而作为黄酮类化合物重要特性的各黄酮种类及其含量与活性间的相关性研究鲜有报道[3-4]。此外，目前对菊花黄酮类化合物的研究通常是对某产地单一品种菊花开展独立研究，鲜见将不同产地、不同品种菊花进行系列研究与比较的报道，故难以发现其中的规律及黄酮类化合物产生功效的作用机制。

基于此，收集来自六个不同产地的菊花，提取黄酮类化合物，测其总黄酮含量，采用HPLC法分析各黄酮类化合物种类及含量，采用DPPH法测其清除自由基能力，以偏最小二乘法(PLS)分析不同菊花中黄酮类化合物成分与清除DPPH自由基间的相关性，探究各黄酮类化合物对体外抗氧化活性间的影响，以期为不同产地菊花中黄酮类化合物功效评价及黄酮类化合物与体外抗氧化活性间的关系提供理论支持。

1 实验试剂与仪器

无水乙醇(无锡市展望化工有限公司)； DPPH(合肥博美生物科技有限责任公司)；黄芩苷(PS010446)、槲皮素(PS010461)、芹菜素(PS010177)对照品均购于成都普思生物科技有限公司；绿原酸(110753-201817)、芦丁(100080-201811)对照品均购于中国食品药品检定研究院。菊泰滁菊1号样品、菊泰滁菊2号样品、杭白菊、亳菊、福建胎菊、河南胎菊均购于滁州百姓缘大药房。

分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；Cary 100 Scan 紫外可见分光光度计(美国Varian公司)；高效液相色谱仪(Agilent 1200型)。

2 结果与讨论

2.1 不同产地菊花中黄酮化合物的提取

分别称取10 g左右六种干燥菊花(杭白菊，亳菊，福建胎菊，河南胎菊，滁菊1号，滁菊2号)加入100 mL 70% 乙醇溶液，于60℃加热回流提取2次，每次2 h，合并两次提取液。于50℃旋蒸至无液体旋出。加入20 mL去离子水混悬，加石油醚进行萃取，浓缩，低温干燥，称重，计算提取率。

菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黄酮化合物的提取率分别为33.89%、35.54%、21.44%、36.09%、32.72%和18.06%。六种菊花中，亳菊的黄酮的提取率最高，福建胎菊最低。

2.2 不同产地菊花黄酮化合物总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线绘制

准确称取0.0200 g芦丁，60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，摇匀，即得0.4 mg/mL芦丁对照液；从对照液中准确移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分别置于7个25 mL容量瓶中；将每个容量瓶用60%乙醇迅速补加至6 mL；向各容量瓶中分别加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，放置6 min后，加入1 mL 10%的硝酸铝，放置6 min后加入10 mL 4%氢氧化钠，用60%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min；于503 nm处测定吸光度，根据芦丁对照品浓度和吸光度的关系绘制标准曲线。Y=10.48X-0.002(X:mg/mL，R=0.9990)，线性范围为0.016～0.096 mg/mL。

2.2.2 样品总黄酮含量的测定

称0.5 g左右各菊花黄酮类化合物提取物用60%乙醇溶液溶解，定容至10 mL。精密移取0.10 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，用60%乙醇补加至6 mL。其它操作按“标准曲线绘制”步骤进行，测其吸光度，代入标准曲线，计算菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黄酮化合物的总黄酮含量分别为12.50%、11.74%、9.47%、18.66%、23.05%和30.30%。六种菊花中，总黄酮含量最高的福建胎菊，最低的是河南胎菊。

2.3 不同产地菊花黄酮化合物种类及含量测定

2.3.1 色谱条件[5-6]

使用 Agilent 1200型高效液相色谱仪进行分析。色谱柱：依利特sinopak C18(4.6 mm×250 mm，5 L)；流动相：甲醇-0.2%乙酸(65∶35)，流速：1.0 mL/min，检测波长：320 nm，柱温: 25 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 混合对照品溶液和供试品溶液的制备

精密称取黄芩苷5.2 mg，槲皮素5.2 mg，绿原酸5.2 mg，芹菜素5.3 mg，芦丁5.2 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL，制得混合对照品溶液。

精密称定各菊花黄酮类化合物提取物适量，加甲醇溶解并定容于25 mL，得供试品溶液。

2.3.3 线性关系考察

精密移取各混合对照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、1.20、2.4 mL至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得不同浓度的混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，得色谱图，如图1A所示，每种黄酮类化合物在色谱中均为单峰。以各黄酮对照品浓度为横坐标( X：mg/mL)，以峰面积(Y)为纵坐标，做回归方程，结果如表1所示。

图1 黄酮混合对照品(A)和菊花中黄酮化合物样品(B)HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of mixture standards (A) and Chrysanthemum (B)

表1 各黄酮化合物线性关系及检出限Table 1 Regression equations,linear range and LODs of the five investigated compounds

2.3.4 精密度、重复性、稳定性试验

取同一混合标准品溶液，按“2.3”项下“色谱条件”连续重复进样测定6 次，计算得黄芩苷、槲皮素、绿原酸、芹菜素、芦丁的峰面积 RSD 分别为3.16%、1.56%、0.65%、3.45%、1.80%，表明仪器精密度较好。

取同一菊花供试品，按“2.3”项下“色谱条件”连续重复进样测定6 次，计算得黄芩苷、槲皮素、绿原酸、芹菜素、芦丁的峰面积 RSD 分别为2.55%、0.99%、0.53%、2.62%、0.83%，表明方法重复性较好。

对照品溶液置于 4℃ 冰箱中，分别在 0、12、24 h 后，按“2.3”项下“色谱条件”测定。经测定得到绿原酸、芦丁、黄芩苷、槲皮素、芹菜素的峰面积的RSD 依次为1.94%、1.94%、3.93%、4.01%、3.44%，说明对照品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.3.5 含量测定

取各供试品溶液，分别按“2.3”项下“色谱条件”进样，色谱图如图1B所示。记录各峰面积，代入相应标准曲线，计算六种菊花样品中黄芩苷、槲皮素、绿原酸、芹菜素、芦丁的含量测定结果见表2。从表2可以看出,在不同来源的菊花样本中5种成分含量有明显的差异,其中绿原酸含量变异范围较大。根据中国药典要求，菊花中绿原酸的含量不应低于0.2%[1]，本实验中六种菊花的绿原酸含量均高于0.63%，符合药典要求。

表2 各菊花中黄酮化合物含量测定结果 %Table 2 Content determination results of flavonoids in different Chrysanthemums

2.4 不同产地菊花黄酮化合物DPPH自由基清除能力测定[7]

分别准确称取各产地菊花黄酮化合物3.0 mg，加入60%乙醇溶解并定容至25 mL，得样品溶液。分别取1.5 mL各黄酮化合物样品溶液于试管中，加入4.5 mL DPPH(0.1045 mmol/L)溶液，室温避光反应30 min，以无水乙醇作为空白实验，在517 nm波长处分别测定吸光度。按下式分别计算DPPH自由基清除率。平行实验3次。

自由基清除率=[A0-(As-Ac)]/A0

式中：A0为1.5 mL蒸馏水+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；As为1.5 mL样品溶液+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；Ac为1.5mL样品溶液+4.5 mL无水乙醇的吸光度。

测定不同产地菊花黄酮化合物对DPPH自由基的清除能力并以抗坏血酸作阳性对照，结果见图2。由图可知不同产地菊花黄酮化合物对DPPH自由基的清除率不同，福建胎菊DPPH自由基清除率相对较高，为73.03%，杭白菊和亳菊DPPH自由基清除率都在50%以上，河南胎菊DPPH自由基清除率为43.65%，来自同一地区的滁菊1号样品和滁菊2号样品的DPPH自由基的清除率相差不大，分别为：39.51%，36.88%，相对较低。

图2 各菊花中黄酮化合物对DPPH自由基的清除率Fig.2 The antioxidant activities against DPPH radicals of flavonoids in different Chrysanthemums

2.5 相关性分析

由表2 及图1可知，菊花黄酮主要由绿原酸、黄芩苷、芦丁、芹菜素、槲皮素组成，但不同产地的菊花黄酮，其成分的量及对抗氧化活性均有所不同。为明确每种成分及量与抗氧化活性间是否有关联，利用Simca-p 11.5软件采用PLS分析法对菊花黄酮的成分种类及量与其对抗氧化活性进行相关性分析，探讨两者的关系。以菊花黄酮成分组成为独立变量(X)，以菊花黄酮成分对抗氧化活性的抑制率作为因变量(Y)，采用PLS进行相关性分析，得到各成分的回归系数。其中系数绝对值反应菊花黄酮不同成分及量对抗氧化活性的大小，回归系数绝对值越大，说明相关性越大；回归系数的符号反应菊花黄酮不同成分与抗氧化活性相关性(正相关或负相关)。拟合出菊花黄酮不同成分及量与抗氧化活性之间的回归线方程为Y= 0.191XQuercetin+ 0.196 XRutin+ 0.215 XBaicalin- 0.070 XApigenin+ 0.272 XChlorogenic acid。由此方程可知，各成分对抗氧化活性的贡献大小为绿原酸 > 黄芩苷 > 芦丁 > 槲皮素 > 芹菜素。其中，绿原酸、黄芩苷、芦丁、槲皮素与黄酮样品的抗氧化活性呈正相关，芹菜素与抗氧化活性呈负相关，且绿原酸对菊花黄酮化合物的抗氧化活性贡献最大，这刚好与文献中报道的结果一致[8]。

3 结论

实验从菊花中提取黄酮化合物，HPLC分析其黄酮组成，DPPH法测其抗氧化活性，并以PLS探究样品黄酮组分与抗氧化活性间的相关性。结果表明各菊花黄酮化合物均具有一定的抗氧化活性，且各菊花黄酮化合物种类及含量存在一定的差异。黄酮化合物组成与抗氧化活性间的相关性研究表明绿原酸、黄芩苷、芦丁、槲皮素与黄酮样品对抗氧化活性呈正相关，芹菜素与抗氧化活性呈负相关。