茶黄素、茶褐素对新慢性高尿酸血症模型小鼠尿酸含量的影响

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(1.福建农林大学园艺学院,福建福州 350002; 2.福建医科大学附属第一医院中心实验室,福建福州 350005; 3.福建农林大学安溪茶学院,福建福州 350002)

尿酸(Uric acid,UA)是嘌呤代谢的最终产物,尿酸高会引发高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA),进而发展成痛风、关节炎等病症。目前,我国约有13.3%的人尿酸偏高,高尿酸血症患者约1.2亿人,痛风发病率达到0.3%[1-2]。高尿酸血症发病年龄逐渐年轻化,主要原因是长期不良的饮食习惯和营养状况,现已和高血压、高血糖、高血脂并称为“四高”[3-4],且彼此呈正相关关系,因此,尿酸与总胆固醇(Total Cholesterol,TCHO)、血糖(Blood glucose,GLU)和甘油三酯(Trilaurin,TG)含量也具有相关性。肾脏是产生尿酸的主要器官,与尿酸生成直接相关,肌酐(Creatinine,CRE)和腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase,ADA)是肾脏的重要组成物质,二者含量的高低是肾脏功能强弱的主要判定方法,因此与尿酸息息相关。另外,肝脏与肾脏之间密切相关,丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)是肝脏的主要形成物质,故和尿酸含量相关。别嘌醇(Allopurinol,API)是用于治疗高尿酸血症的药物,能抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少尿酸的合成,但有严重的副作用如过敏、皮疹、腹泻,甚至会抑制骨髓血细胞前体的活性,减少全血细胞[5-6]。因此,寻找代替别嘌醇的物质十分重要。

六大茶类中,乌龙茶的茶黄素含量比较高,黑茶的茶褐素含量比较高[7]。前人对茶多酚[8-9]、儿茶素[10-14]以及绿茶提取物[15-16]、红茶提取物[17]、黑茶提取物[18]在降尿酸方面的研究取得一定进展,但是茶黄素(Theaflavins,TF)和茶褐素(Theabrownine,TB)对小鼠降尿酸作用尚未明确。

本研究以喂食自主设计的特制饲料建立了慢性高尿酸血症小鼠的新模型,连续给小鼠灌胃茶黄素和茶褐素,断尾取血检测尿酸含量及其它相关生化成分,比较不同浓度的茶黄素、茶褐素对小鼠患高尿酸血症的预防及改善作用的差异,为乌龙茶、黑茶的保健功效研究和降尿酸的辅助产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CR小鼠 SPF级I,54 只,8 周,雌性,20～22 g,福建医科大学实验动物中心(动物生产许可证号:SCXK(闽)2016-0002)，适应性喂养一周后开始实验;别嘌醇、氧嗪酸钾 湖北巨胜科技有限公司;茶黄素(纯度99%) 上海金畔生物科技有限公司;茶褐素(纯度90%) 济南鲁源生物科技有限公司;普通饲料(许可证号:SXCK(辽)2017-0001) 沈阳茂华生物科技有限公司;酵母粉(许可证号:SC20142050300018) 安琪酵母股份有限公司;蛋黄粉(许可证号:豫XK13-217-00123) 洛阳奇泓生物科技有限公司;海鱼粉(许可证号:冀饲证201907933) 海兴瑞祥饲料有限公司;白糖(许可证号:SC12153092204984) 云南云县甘化有限公司;玉米粉(许可证号:SC10161042201225) 三原星缘农副产品加工有限公司;猪油(许可证号:SC10337130200099) 临沂新程金锣肉制品集团有限公司;胆固醇(C8280)、猪胆盐(G8310) 北京索莱宝科技有限公司。

5424R小型台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司;ADVIA2400全自动生化分析仪 美国西门子医学诊断产品有限公司;HW-2旋涡混合器 常州市金坛友联仪器研究所;BSA6202电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 特制饲料配制 参考文献[19],自制特制饲料。特制饲料是以酵母粉10%、蛋黄粉10%、海鱼粉20%、氧嗪酸钾0.1%、白糖15%、玉米粉15%、猪油10%、胆固醇4%、猪胆盐0.3%和普通饲料15.6%配制加工而成。

1.2.2 动物分组及实验方法 将54只ICR小鼠随机分成9组,分别为正常组、模型组、茶黄素低、中、高3个剂量组(TF1、TF2、TF3)、茶褐素低、中、高3个剂量组(TB1、TB2、TB3)、阳性组,每组6只,实验分组饲料及灌胃样品剂量详见表1,所有实验动物均在(23±2) ℃下饲养,每天12 h日光灯照射(7 am～7 pm),自由进食和饮水。阳性组隔天灌胃,其余组连续灌胃21 d。第21 d灌胃药物1 h后,称量小鼠体重,处死小鼠,称量其心、肝、肺、肾四个脏器的重量并计算脏器系数(脏器系数=脏器重量/小鼠体重)。

表1 不同浓度的茶黄素、茶褐素 对高尿酸血症小鼠的尿酸抑制实验Table 1 Uric acid inhibition test of different concentrations of theaflavins and theaflavins on hyperuricemia mice

1.2.3 指标检测 第21 d给所有小鼠摘眼球取血,加1.5% EDTA抗凝剂50 μL,至3000 r/min离心5 min,取上清液于4 ℃保存静置12 h后放置全自动生化分析仪检测血清中的尿酸(UA)、总胆固醇(TCHO)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、腺苷酸脱氢酶(ADA)、肌酐(CRE)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)指标。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 新慢性高尿酸血症模型的建立

模型组与正常组相比,血清的尿酸含量极显著增高57%(P<0.01，见表2),说明用特制饲料喂食小鼠致慢性高尿酸血症造模成功,且不影响小鼠生命、生理活动。同时,模型组的血清TCHO、ADA、AST与正常组相比分别极显著升高111%、279%、100%(P<0.01),血清ALT与正常组相比显著升高31%(P<0.05),血清GLU极显著降低63%(P<0.01),血清CRE、TG含量与正常组相比无显著性,说明喂食特制饲料对小鼠的胆固醇、血糖含量有非常明显的影响,且对小鼠肝脏、肾脏有一定影响。

表2 新慢性高尿酸血症小鼠模型与正常组的对比Table 2 Comparison of new chronic HUA mice model and contorl group

注:小写字母不同表示各试样间差异显著,P<0.05;大写字母不同表示各试样间差异极显著性,P<0.01;表2同。

2.2 对HUA小鼠体重及变化量的影响

模型组与正常组相比体重显著降低10.7%(P<0.05，图1),说明喂食特制饲料会显著影响小鼠体重。与模型组相比,灌胃200 mg/kg茶褐素使小鼠体重极显著上升8%(P<0.01);灌胃浓度为400 mg/kg时,茶黄素和茶褐素均使小鼠体重上升,灌胃800 mg/kg茶褐素也使小鼠体重升高,但没有显著性差异;灌胃800 mg/kg茶黄素后小鼠体重略有下降;灌胃阳性药对小鼠体重几乎没有影响。

图1 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠体重的影响Fig.1 Effect of TF and TB on weight in HUA mice注：模型组与正常组比较：*表示差异显著P<0.05， **表示差异极显著P<0.01；与模型组比较： #表示差异显著P<0.05，##表示 差异极显著P<0.01，图2～图6同。

各组小鼠在第21 d后的体重变化量,见图2。其中,与模型组相比,200 mg/kg茶黄素组、200、400、800 mg/kg茶褐素组这4组的体重变化量显著高于模型组小鼠的体重变化量，且增加量超过20%；模型组、阳性组、400、800 mg/kg茶黄素组的小鼠体重增加量与其它组相比较低。说明喂食特制饲料后,灌胃不同浓度的茶褐素和200 mg/kg茶黄素对小鼠的体重均有升高作用,而灌胃400、800 mg/kg茶黄素对小鼠体重增长有轻微的抑制作用。

图2 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠体重变化量的影响Fig.2 Effect of TF and TB on the weight changes of HUA mice

2.3 对HUA小鼠血清尿酸含量的影响

与模型组相比,灌胃800 mg/kg茶黄素后,小鼠血清尿酸水平极显著减少20%(P<0.01，图3);阳性组的血清尿酸含量极显著降低18%(P<0.01);灌胃400 mg/kg茶黄素对小鼠血清尿酸含量没有显著影响,灌胃400、800 mg/kg的茶褐素和200 mg/kg茶黄素组小鼠尿酸含量反而升高。根据文献报道[20],茶褐素能调节尿酸水平,预防心脑血管疾病。本实验在检测过程中发现灌胃茶褐素反而会刺激尿酸升高,其原因可能是茶褐素作为提取纯化后的单体物质对小鼠尿酸的作用不如纯茶效果好,或可能是实验模型或实验对象不同导致的结果差异。综上,灌胃800 mg/kg茶黄素对HUA小鼠有降尿酸作用且效果较好,另外,灌胃不同浓度的茶黄素对高尿酸血症小鼠的降尿酸作用存在差异,效果表现为:800 mg/kg茶黄素>400 mg/kg茶黄素。

图3 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠血清尿酸含量的影响Fig.3 Effect of TF and TB on serm uric acid contents of HUA mice

2.4 对HUA小鼠血清中TCHO、GLU、TG含量的影响

与正常组相比,喂食特制饲料后,模型组小鼠的血清TCHO含量显著升高210%(P<0.05，见图4),血清GLU含量则极显著降低了63%(P<0.05),血清TG含量没有显著变化。与模型组相比,灌胃400、800 mg/kg茶黄素能极显著升高血清中TCHO含量(P<0.01);灌胃200、800 mg/kg茶黄素能极显著升高小鼠血清GLU的含量(P<0.01);灌胃不同浓度的茶黄素均能降低小鼠血清TG含量,但没有显著性差异。与模型组相比,灌胃不同浓度的茶褐素均能降低小鼠血清TCHO和TG含量;但没有显著性差异;灌胃不同浓度的茶褐素均能升高小鼠血清GLU含量。阳性组能极显著降低小鼠的血清TCHO含量(P<0.01),对血清GLU、TG含量没有显著影响。说明茶黄素对高尿酸血症小鼠的血清TG含量有降低作用,对高尿酸血症小鼠的血清GLU含量、TCHO含量有升高作用;茶褐素对高尿酸血症小鼠的血清TG含量有降低作用,对高尿酸血症小鼠的血清GLU含量有升高作用,对血清TCHO含量有降低作用。可以看出,茶黄素和茶褐素对喂食小鼠特制饲料导致的低血糖有较好的缓解作用,同时对小鼠血脂含量有改善作用,但二者对小鼠胆固醇含量的影响不明显。

图4 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠血清总胆固醇、 葡萄糖、甘油三酯含量的影响Fig.4 Effect of TF and TB on serum TCHO, CLU,TG contents of HUA mice

2.5 对HUA小鼠ADA、CRE的影响

与正常组相比,喂食特制饲料后,模型组小鼠的血清ADA含量极显著升高379%(P<0.01，见图5),血清CRE含量有降低但没有显著性差异。与模型组相比,阳性组对小鼠血清ADA含量显著下降(P<0.05),血清CRE含量显著上升(P<0.05)。与模型组相比,灌胃不同浓度的茶黄素能能显著降低小鼠血清ADA含量(P<0.05);灌胃800 mg/kg茶黄素的高尿酸血症小鼠血清CRE含量显著下降(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶黄素的高尿酸血症小鼠血清CRE含量显著上升(P<0.05);灌胃400 mg/kg茶黄素对血清CRE含量没有显著影响。灌胃不同浓度茶褐素的血清CRE含量显著升高(P<0.05);灌胃400、800 mg/kg茶褐素的血清ADA含量显著升高(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶褐素的血清ADA含量显著下降(P<0.05)。可以看出,茶黄素对小鼠的肾脏损伤有改善作用,而茶褐素的效果不理想。

图5 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠 血清腺苷酸脱氢酶、肌酐含量的影响Fig.5 Effect of TF and TB on serum ADA,CRE contents of HUA mice

2.6 对HUA小鼠ALT、AST的影响

与正常组相比,喂食特制饲料后,模型组小鼠的血清ALT、AST含量均显著升高(P<0.05,见图6)。与模型组相比,阳性组的小鼠血清AST含量显著降低(P<0.05),ALT含量降低,但差异不显著。与模型组相比,灌胃不同浓度的茶黄素均能显著降低高尿酸血症小鼠的血清ALT含量(P<0.05);灌胃200、800 mg/kg茶黄素能极显著降低高尿酸血症小鼠的血清AST含量(P<0.01),灌胃400 mg/kg茶黄素对高尿酸血症小鼠的血清AST含量没有显著性影响。灌胃400、800 mg/kg茶褐素的小鼠血清ALT含量极显著升高(P<0.01),小鼠血清AST含量显著升高(P<0.05);灌胃200 mg/kg茶褐素的高尿酸血症小鼠血清ALT含量升高,血清AST含量降低,但均无显著性差异。可以看出,茶黄素对小鼠的肝脏损伤有改善作用,而茶褐素的效果不理想。

图6 茶黄素、茶褐素对HUA小鼠 血清腺苷酸脱氢酶、肌酐含量的影响Fig.6 Effect of TF and TB on serum ALT,AST contents of HUA mice

2.7 对HUA小鼠脏器系数的影响

与正常组相比,模型组小鼠的心、肝、肺、肾器官重量均有升高,脏器系数也均大于正常组,说明喂食特制饲料能使慢性高尿酸血症小鼠脏器变大,对脏器有不良影响(见表2)。

表3 不同浓度的茶黄素、茶褐素对HUA小鼠脏器重量和脏器系数的影响(n=6)Table 3 Effects of different concentrations of TF and TB on organ weight and organ coefficient in HUA mice(n=6)

灌胃不同浓度的茶黄素能降低小鼠的心脏、肝脏重量。其中,灌胃400 mg/kg茶黄素组的小鼠心脏重量与正常组最接近,灌胃800 mg/kg茶黄素组的小鼠肺脏重量与正常组最接近,说明茶黄素能够适当保护HUA小鼠的心、肺。

灌胃不同浓度的茶褐素能降低小鼠的肝脏重量,降低肝脏系数。200 mg/kg茶褐素组的小鼠心脏重量与正常组最接近,脏器系数也相同,说明茶褐素能适当保护高尿酸血症小鼠的心脏。阳性组的小鼠脏器重量均低于模型组,与正常组相近,说明API能适当保护HUA小鼠的脏器。

3 结论与讨论

本实验通过酵母粉、海鱼粉、蛋黄粉等多种物质配制成的特制饲料饲喂小鼠建立新慢性高尿酸血症小鼠模型,研究茶黄素和茶褐素对HUA小鼠的降尿酸作用。研究发现,茶黄素对新慢性高尿酸血症小鼠的尿酸含量有明显降低作用,且不同浓度的茶黄素对高尿酸血症小鼠的降尿酸作用效果表现为:800 mg/kg茶黄素>400 mg/kg茶黄素>200 mg/kg茶黄素。

与空白对照组相比,这种慢性高尿酸血症小鼠模型能使GLU含量显著降低;这与宋春蕾等[21]结果尿酸与血糖之间存在的正相关关系有不同,其原因有待进一步的研究探索。通过灌胃不同的茶叶天然活性成分,小鼠的GLU含量与模型组相比能显著上升,但与空白对照组相比,各组小鼠的GLU含量总体均有降低。说明灌胃不同茶叶天然活性成分对正常小鼠的GLU含量有降低作用。与模型组相比,茶褐素对新慢性高尿酸血症小鼠的尿酸含量没有降低作用。实验发现高浓度的茶黄素对喂食特制饲料造成的高尿酸血症小鼠有显著降低尿酸含量的作用,同时还能显著降低血清AST、ADA、TG含量;茶褐素对高尿酸血症小鼠的血清CRE含量有显著升高作用,灌胃400、800 mg/kg对高尿酸血症小鼠的ALT、TG含量有还能显著升高小鼠的血清ADA含量;高尿酸血症小鼠的体重;二者均有一定的保护小鼠心、肺的作用。根据本实验结果的变化趋势推测,低于200 mg/kg茶褐素可能有一定作用,但该推测有待于进一步研究。此外,实验过程中有多组小鼠的毛色与正常组相比较灰黄暗淡,解剖过程中发现1例小鼠的肝器官癌变,有可能是喂食特制饲料引起对体内蛋白合成和基础代谢的影响。关于茶黄素和茶褐素对体内蛋白合成和基础代谢是否有一定的影响,茶黄素、茶褐素对尿酸转运蛋白的基因表达量的变化是否有影响,还有待进一步的研究。关于茶黄素的保健功效是今后茶叶天然活性成分的研究重点之一,本实验发现给小鼠灌胃茶黄素能降低其尿酸含量,为茶黄素被用于开发新的降尿酸保健品或辅助产品提供实验依据和研究方向。