HPLC-ELSD法测定长白山笃斯越桔果实中可溶性糖含量

王 瑜,杨浩博,仲 帅,刘 鑫,盛煜钧,李 彤,宗成文

(延边大学农学院,吉林延吉 133002)

笃斯越桔(Vacciniumuliginosum)是杜鹃花科越橘属的多年生落叶灌木,在我国主要分布于黑龙江大、小兴安岭、吉林长白山等地[1-2],是我国重要的野生浆果资源,具有较高的研究价值[3-5]。笃斯越桔果实中不仅含有丰富的花青苷、黄酮醇苷和原花青素等功能活性成分[6],还有大量的糖酸等影响果实口感的风味物质。

果实的品质取决于其可溶性固形物、香味和质地等特性,尤其是糖酸含量和比率[7]。随着果实成熟,不溶性的淀粉变成可溶性的蔗糖、葡萄糖、果糖等积累于细胞质中,使甜味增加[8]。可溶性糖是衡量果实甜度和风味品质的重要指标[9],也是色素、氨基酸、维生素和芳香物质等其他营养成分合成的基础原料[10]。关军锋[11]研究指出水果中的可溶性糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖。有的水果还含有木糖、山梨醇、甘露醇等[12]。不同种类甚至同一种类不同品种的水果,可溶性糖构成可能存在差异,多数水果以果糖、蔗糖和葡萄糖中的某一种为主[13]。

果实中可溶性糖的测定方法主要有分光光度法、气相色谱法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱法等[14]。分光光度法仪器设备简单,操作简便,但准确度相对不高;气相色谱在使用前需要对不易挥发的糖进行衍生化反应,过程繁琐复杂;高效毛细管电泳法分离较好,但是稳定性较差,所测数据精密度、重复性不高[15-16];高效液相色谱法的高效性、简便性、灵敏度以及测试结果的重现性、精密度都很高,近几年在沙棘[17]、蓝果忍冬[18]、黑果醋栗[19]等浆果中广泛使用。测定可溶性糖含量的检测器与测定有机酸的检测器不同,主要有示差折光检测器(RID)和蒸发光散射检测器(ELSD)。RID虽然能检测出糖含量,但是其检测灵敏度低,受温度影响大;ELSD其稳定性好、灵敏度高、精密度高、无溶剂峰干扰[20-22]。本试验建立并优化HPLC-ELSD法测定笃斯越桔果实可溶性糖含量的方法,比较长白山区2个不同居群笃斯越桔果实糖含量,筛选出高糖种质,以期为笃斯越桔果实品质评价、生产加工及种质资源保存利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

笃斯越桔成熟果实 以长白山区的东方红林场(平均海拔1253 m)和兰家林场(平均海拔836 m)采集2个不同天然居群(每个居群20个样本,每两个样本间距30 m)共40个(盛花后60 d),在采样后选择未受损害的成熟果实留样速冻置于-20 ℃冰箱中保存,在全部采样后进行可溶性糖分析;果糖(99.7%)、葡萄糖(98.7%)、蔗糖(99.5%) 北京坛墨质检-标准物质中心;乙腈 色谱纯,天津市赛孚瑞科技有限公司。

Primaide高效液相色谱仪 日本Hitachi有限公司;ELSD3300检测器 美国Alltech公司;TCL-16G型高速心机 上海安亭科学仪器厂;KQ-250B型超声波清洗器 总功率750 W、频率40 kHZ,昆山市超声仪器有限公司;ME204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件的选择 在流动相(乙腈∶水=70∶30,V/V)、流速(1.0 mL·min-1)等为最初研究条件下,本试验优化了3个柱温,分别是30、35和50 ℃;流动相中乙腈比例的增大会影响基线的噪音及各峰的分离度,所以测试了在柱温(35 ℃)、流速(1.0 mL·min-1)等条件不变的情况下,当流动相中乙腈:水分别为70∶30、75∶25、80∶20 (V/V)时的分离度;ELSD检测器的漂移管温度是影响实验结果的重要参数,本试验在流动相为乙腈和水的体积比为75∶25,流速为1 mg·min-1,柱温为35 ℃不变的条件下,设置漂移管温度为50和80 ℃两个条件,来检测是否达到理想的分离效果。

最终确定的色谱条件为:ELSD Alltech 3300检测器;色谱柱为CAPCELL PAK NH2UG80 S5(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(75∶25,v∶v);流速1.0 mL·min-1;柱温35 ℃;漂移管温度80 ℃;载体为高纯N2,流速为1.0 L·min-1;进样量5 μL。

1.2.2 标准溶液的制备 精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖各100 mg,用超纯水溶解并定容于10 mL容量瓶中,摇匀,0.45 μm滤膜过滤,得到可溶性糖混合标准品母液。用超纯水稀释混合标准品母液,得到果糖、葡萄糖、蔗糖质量浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1的一系列混标溶液,放入4 ℃冰箱待测。以可溶性糖质量浓度(mg·mL-1)为横坐标,峰面积(mV)为纵坐标,建立线性回归方程。

1.2.3 样品溶液的制备 精密称取1 g在兰家林场采集的笃斯越桔果实,加入5 mL超纯水研磨成匀浆,倒入5 mL离心管中,室温下超声处理5 min后,12000 r·min-1下离心15 min,收集上清液。滤渣按上述方法再提取一次,合并提取液,用超纯水定容至20 mL,0.45 μm水系滤膜过滤,待测。

1.2.4 方法学的考察

1.2.4.1 精密度试验 将1 mg·mL-1的混合标准品溶液按照1.2.1的色谱条件连续进样6次,根据所得峰面积分别计算精密度及果糖、葡萄糖、蔗糖的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD1)。

1.2.4.2 重复性试验 取笃斯越桔果实,按1.2.3的样品溶液的制备方法分别提取6份,分别进样,计算样品各可溶性糖峰面积的RSD2。

1.2.5 加标回收率试验 精确量取1 mL样品,加入果糖质量浓度为1.25 mg·mL-1和葡萄糖质量浓度为1.0 mg·mL-1的混合标准品溶液0.1 mL;各待测液混合后,用0.45 μm水系滤膜过滤,根据加入标准品质量浓度与检出质量浓度来计算回收率,实验平行6次。

1.2.6 笃斯越桔果实可溶性糖含量的测定 将笃斯越桔果实按照1.2.3的方法制备三份,按照1.2.1的色谱条件进样分析,根据峰面积算出笃斯越桔果实中果糖、葡萄糖的含量,并根据果糖,葡萄糖算出总糖含量。甜度值的计算参照姚改芳等[23]的方法,蔗糖的甜度值为1.00,果糖为1.75,葡萄糖为0.70,甜度值=蔗糖含量×1.00+果糖含量×1.75+葡萄糖含量×0.70。

1.3 数据处理

所有试验三次重复。采用Excel 2010处理原始数据以及平均值、标准差的计算。采用SPSS 19.0(IBM Co.,Chicago,IL,USA)进行单因素方差分析、多重比较(Ducan法,P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 柱温的确定 由图1可见,随着柱温的升高,各组分在色谱柱内的保留时间都有所缩短,但在50 ℃时果糖和葡萄糖分离效果不好,在30 ℃时,蔗糖有杂峰,且没有从基线分离出来,故选择35 ℃作为柱温。

图1 不同柱温下可溶性糖的色谱图Fig.1 Chromatograms of soluble sugars under different column temperature注:A:柱温为30 ℃;B:柱温为35 ℃;C:柱温为50 ℃。

2.1.2 流动相比例的确定 由图2可知,提高乙腈的比例可以更好的提高糖的分离程度,当流动相乙腈和水体积比为75∶25时,相邻两峰分离效果较好,且分离时间较短,在10 min以内就可以分析一个样品,综合考虑保留时间及分离度,采用乙腈和水的体积比为75∶25作为流动相。

图2 乙腈和水不同体积比的可溶性糖色谱图Fig.2 Chromatogram of soluble sugars in different volume ratio of CH3CN and H2O注:A:乙腈和水的体积比为70∶30;B:乙腈和水的 体积比为75∶25;C:乙腈和水的体积比为80∶20。

2.1.3 漂移管温度的确定 漂移管温度会影响检测器的灵敏度。根据文献指出由于漂移管温度过低时流动相蒸发不完全,导致基线噪音上升,分离不完全;温度过高时流动相又会完全蒸发,导致信噪比增大[21]。所以最佳温度需要通过观察各温度时信噪比和分离度来确定。如图3,漂移管温度为50 ℃,果糖和葡萄糖没有达到基线分离,综合考虑选择漂移管温度为80 ℃。

图3 不同漂移管温度下可溶性糖的色谱图Fig.3 Chromatogram of soluble sugars in different drift tube temperature注：A:漂移管温度为50 ℃；B:漂移管温度为80 ℃。

2.2 HPLC图谱分析

取果糖、葡萄糖、蔗糖标准品的混标溶液,进样5 μL,色谱图见图4A。由图4A可以看出,3种可溶性糖基本达到基线分离,峰形良好。取笃斯越桔样品溶液,进样5 μL,色谱图见图4B。由图4B可知,笃斯越桔果实中主要含有果糖、葡萄糖,两种糖分离度较好。并没有检测出蔗糖及其他可溶性糖,这与对越桔糖酸组分及含量分析中的可溶性糖主要有果糖和葡萄糖为主的研究结果大致相同[24],与张英春等[16]报道不同的是,本试验没有检测出蔗糖,这可能与大兴安岭地区与长白山地区生长环境以及遗传与其他环境因素多因素共同作用的结果[25-27]。

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的回归方程、精密度和重复性试验结果 表1的结果显示,通过将混合标准品溶液稀释的6个浓度梯度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1)所成的线性相关系数在0.9994～0.9995之间,说明糖酸组分的峰面积与含量的线性关系良好。糖组分测定的RSD1在1.08%～2.09%之间,RSD2在0.80%～2.73%之间,表明该方法重复性良好,所用仪器的精密度良好。

表1 糖组分的线性回归方程及精密度和重复性(n=6)Table 1 Linearity,precision and repeatability determination of sugar(n=6)

表2 可溶性糖测定的回收率实验(n=6)Table 2 Recovery rates of soluble sugars in spiked samples(n=6)

图4 优化条件下糖标准品(A)及样品(B)色谱图Fig.4 The sugars standard(A)and sample(B) chromatograms under optimization conditions

2.3.2 回收率试验结果 两种可溶性糖的平均回收率为102.83%和106.29%,表明方法准确率高。结果如表2所示。

2.4 不同居群长白山笃斯越桔果实中糖含量

笃斯越桔果实内果糖含量最多,其次为葡萄糖。表3方差分析结果显示,笃斯越桔果实中的果糖、葡萄糖、总糖和甜度值在不同居群间差异达到了极显著水平(P<0.01)。

不同居群内可溶性糖含量显著(P<0.05)(表4),海拔高的东方红林场果糖、葡萄糖和总糖的平均含量高于兰家林场,东方红林场的平均甜度值达到85.33,远高于兰家林场的56.61。DFH-11(东方红居群内第11个样本)的果糖含量显著高于居群内其他19个样本(P<0.05);DFH-11和DFH-14的葡萄糖含量显著高于居群内其他样本(P<0.05),总糖含量最高的是DFH-11,为89.37 mg·g-1FW,含量最低的是DFH-16,仅有38.79 mg·g-1FW。东方红林场内甜度最高的是DFH-11,高达110.77。兰家林场中LJ-6样本果糖、葡萄糖和总糖含量显著(P<0.05)高于居群内其他样本;甜度值最高的是LJ-6样本,为88.63,但与东方红林场的DFH-11样本相比,低了22.14。因此DFH-11具有潜在的应用前景,是长白山笃斯越桔育种工作的首选材料。

表3 不同居群笃斯越桔果实可溶性糖含量的方差分析Table 3 The ANOVA analysis of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

表4 不同居群笃斯越桔果实可溶性糖含量的多重比较Table 4 Multiple comparison of soluble sugar content in Vaccinium uliginosum fruits from different populations

3 结论

本试验采用HPLC-ELSD法对长白山区不同居群笃斯越桔果实可溶性糖含量进行测定,并建立优化建立稳定准确的色谱条件。结果显示,HPLC-ELSD法简便快捷,灵敏度高,能够准确测定出笃斯越桔果实中可溶性糖含量。长白山笃斯越桔果实糖分主要为果糖和葡萄糖。2个居群中海拔高的东方红林场的果糖、葡萄糖、总糖含量及甜度值明显高于海拔低兰家林场。居群内糖含量及甜度值差异显著,2个居群40个样本中DFH-11的总糖含量及甜度值最高,具有潜在的应用前景,是长白山笃斯越桔育种工作的首选材料。刘玉兰[28]指出总糖对酿酒葡萄的品质、口感以及深加工有很大影响,可见本试验为高效利用优异种质资源提供理论依据,对笃斯越桔资源开发利用和保护有重要意义。

续表

注:不同小写字母代表相同林场相同指标差异达显著水平(P<0.05)。