菲律宾蛤仔不同组分中重金属存在形态研究

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(1.大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023; 2.浙江省检验检疫科学技术研究院,浙江杭州 310016)

菲律宾蛤仔是沿海主要养殖的海产贝类之一[1],味道鲜美且具有较高的营养价值,氨基酸的类别组成及含量比例合理[2]，含有各类维生素及药用成分以及人体必需的多种微量元素,因此备受青睐。但其因滤食性、活动性差等生活特点易受到如重金属等污染物的污染[3],重金属超标的贝类产品不仅会威胁人们的身体健康,还会影响产品的出口贸易制约经济发展。金属元素不仅可以溶解状态存在,还会以颗粒态形式存在[4]。颗粒态重金属的形成过程是重金属与有机配位基和形成络合物的电子供体相结合,因此呈现多种形态,相关研究表明,金属元素在食品中存在形态对生物吸收利用率产生关键影响[5]。不同的存在形态会极大地影响其生物的吸收、利用及体内分布,造成不同的生物效应或产生生理毒害作用[6]。不同存在形态的颗粒态重金属的结合强度差异较大,因此导致生物效应不同,稳定性强弱依次为可交换态>硫化物结合态>结合态>残渣态[7]。可交换态金属对环境的变化最为敏感,且最易被生物体吸收,硫化物结合态是酸可提取态,可交换态金属和硫化物结合态属于相对易可给态重金属;有机物结合态和残渣态对环境变化不敏感,不易被生物吸收,均属于惰性态重金属,且残渣态对生物无效应[8]。

近年来有关形态分析的报道逐渐增多,如Brezonik等[9]及Foerstner等[10]都对形态分析作了专题讨论。逐级化学提取法(SCEE)又称逐级提取或连续提取,可将复杂体系中不同存在形态的颗粒态重金属提取出来,便于之后的分析讨论[11]。此方法基于Tessier五步连续提取法,根据研究土壤中微量元素存在状态的方法进行改进而发展起来[12],在定量研究重金属元素存在状态的研究中得到了广泛的应用。根据不同形态元素的溶解度在溶剂中交换强度的差异,将样品中的颗粒态重金属依次提取到目标溶液中[13]。选择合适的重金属元素提取剂,依次提取可交换态、硫化物结合态、有机物结合态、残渣态(形态划分由Siebielec等[14]确立)。提取的各种形态之和应该等于元素的总量[15],所以可由回收率对方法的可行性进行检测,但是由于城市空气中存在重金属的悬浮物,可能会造成提取的一部分重金属并不全来源于样品中,所以此方法也存在一定的误差[16]。许多学者对菲律宾蛤仔和牡蛎中的金属进行了深入研究,吕永红[17]的研究证实了各种浓度的镉离子对菲律宾蛤仔呼吸过程均具有较显著的抑制作用;孟慧等[18]研究实验发现牡蛎中锌的主要存在形态是无机态,且有少量以有机结合态形式存在;蔡立哲等[19]实验结果显示,菲律宾蛤仔的鳃和软体部位的铅、锌含量与实验水体中的铅、锌浓度成正比,但鳃对铅、锌的积累量较高。仇红萍[20]对牡蛎的研究中发现牡蛎内脏团中的镉元素超出国家食品卫生限量标准范围。

本文将逐级化学提取技术应用到菲律宾蛤仔中重金属元素的形态研究上,并验证其可行性。实验以铅、锌、镉三种重金属为例研究菲律宾蛤仔中重金属元素分布及存在形态,将新鲜的菲律宾蛤仔通过差速离心制备成细胞质、细胞核、线粒体三种组分,分别测定这三种组分的铅、镉、锌重金属含量及存在形态,根据重金属含量的测定结果得出重金属在细胞中的分布及存在形态特点,可为以后评估贝类中的重金属毒性提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的菲律宾蛤仔 体长2～3 cm,采购于大连长兴市场;氯化钠、浓硝酸 天津市大茂化学试剂厂;铅、锌、镉重金属离子标准溶液 单标,国家有色重金属及电子材料分析测试中心;氯化镁、30%过氧化氢 天津市科密欧化学试剂有限公司;超纯水 实验室自制。

FD-1型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;DS-1型高速组织捣碎机 上海标本模型厂;FW高速万能粉碎机、可调试电陶炉 天津市泰斯特仪器有限公司;GZX-GF型电热恒温鼓风干燥箱 上海龙跃仪器设备有限公司;KQ-C玻璃仪器气流烘干器 巩义市予华仪器有限责任公司;Optima 8000 ICP原子发射光谱仪 美国PerkinElmer公司;Milli-Q超纯水仪 法国Millipore;AR224CN型电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘怡实验仪器开发有限公司;HH-2型数显恒温水浴锅 金坛市江南仪器厂;PB-10酸度计 Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 组分制备 将采购的新鲜菲律宾蛤仔先用过滤海水冲净其表面的淤泥、脏杂物等附着物,选择壳体无破损、正常活动、大小基本一致的蛤仔放入冰柜冷冻,次日取出,称取1.5 kg,于室温稍微解冻后除去外壳,用大张滤纸吸干蛤肉上多余的水分,保留整体蛤肉并称重,之后将蛤肉剪碎,加入两倍蛤肉体积的0.75%氯化钠溶液,用均质机粉碎,粉碎得到的原液进行差速离心,以转速2000×g离心10 min,沉淀物即为细胞核组分,将上清液继续以10000×g的离心10 min,上清液即为细胞质组分,沉淀物为线粒体组分,冻干并打粉,于-20 ℃干燥条件下存储。

1.2.2 重金属含量测定

1.2.2.1 标准曲线 重金属标准溶液(储备液):取1个已泡酸的容量瓶(100 mL),按表1加入重金属标准液,用HNO3(0.5%)定容,摇匀备用。

表1 金属标准溶液(储备液)配制方法Table 1 Preparation method of metal standard solution(stock solution)

重金属标准溶液(工作液):取7个已泡酸的50 mL石英瓶,分别加入0、1.0、5.0、10.0、18.0、25.0、35.0 mL重金属标准溶液(储备液),用0.5%硝酸定容至刻度,摇匀备用。将定容好的重金属标准液(工作液)用原子发射光谱仪按浓度从低到高依次进行测定,根据测得的强度值与工作液浓度绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品湿法消化 准确称取细胞质、细胞核、线粒体各0.2 g,分别加入10 mL优级纯硝酸于50 mL已泡酸过夜的石英瓶中,于200～300 ℃加热板上加热消化2～3 h,若未完全消化或酸液过少,则需补加几毫升硝酸继续消化,直至变成透明无色,冷却后用超纯水定容于100 mL的容量瓶内[21],同时做空白实验。

1.2.2.3 样品重金属含量测定 检测条件为:等离子体气流量20 L/min;辅助气流量0.3 L/min;雾化器气体流量0.24 L/min;蠕动泵转速:1.0 mL/min。Pb、Zn、Cd这3种重金属元素的检测波长分别是:220.35、206.20、228.80 nm。

将样品消化液用0.45 μm过滤器过滤,并稀释10倍,进样前先用0.5%硝酸冲洗系统3～5 min,先对空白样进行测定。每进一组平行待测样冲洗一次,每次冲洗2 min,记录实验数据。测定结束先用5%硝酸冲洗10 min,再用超纯水冲洗10 min,最后将进样孔暴露于空气中使整个系统将液体排空。

1.2.2.4 重金属含量计算 用原子发射光谱仪测出的数据为强度,将强度代入标曲求出X值。

重金属含量(mg/g)=X×V×A/M

式中：V-容量瓶体积(mL);A-稀释倍数;M-样品重量(g);X-溶液浓度值(mg/mL)。

1.2.2.5 可交换态重金属的提取 准确称取细胞质、细胞核、线粒体各0.1 g,每个样品进行三次平行实验分别加入15 mL 1 mol/L MgCl2溶液,在室温下振荡4 h,以 4000 r/min的转速离心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶内[22]。

1.2.2.6 硫化物结合态重金属的提取 将离心所得沉淀物分别用10 mL超纯水漂洗,以4000 r/min的转速离心10 min,弃掉上清液,取残余物分别添加15 mL HNO3溶液,置于100 ℃水浴中加热30 min,间歇振荡,以4000 r/min的转速离心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.7 有机物结合态重金属的提取 硫化物结合态获得的沉淀物各用10 mL超纯水漂洗,以4000 r/min的转速离心10 min,将上清液弃掉,取残余物分别加10 mL超纯水,以稀硝酸调节溶液pH至2.0,加入5 mL 30%的H2O2,置于80～85 ℃水浴中加热约5 h,间歇振荡,以4000 r/min的转速离心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶中[22]。

1.2.2.8 残渣态重金属的提取 有机物结合态得到的残余物分别用10 mL超纯水漂洗,离心,将上清液弃掉,取残余物。加入10 mL优级纯硝酸于50 mL已泡酸过夜的石英瓶中,于200～300 ℃加热板上加热消化2～3 h,若未完全消化或酸液过少,则需补加几毫升酸液继续消化,直至变成透明无色,冷却后用超纯水定容于50 mL的容量瓶内,用封口膜缠绕放入冰箱中冷藏。取与消化样相同量的酸液,按上述步骤做空白试验[23]。

1.2.2.9 各存在形态金属含量及回收率测定 采用原子发射光谱法[24]测定提取后各存在形态金属元素的发射光强度,由工作曲线算出相应的含量[25],具体操作方法同1.2.2.3样品重金属含量测定。

各种重金属回收率计算公式如下:

回收率(%)=重金属各存在形态含量之和/重金属总量×100

1.3 数据处理

所有实验数据均重复测定三次,测定结果为平均值±标准差,进行统计学分析,P<0.05时认为数据具有显著性差异。实验数据采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理、分析与作图计算各形态在各组分的占比情况,用原子发射光谱仪测出的数据为强度,将强度值代入标曲求出X值,即为各形态在各组分的含量,并计算相应百分比。

2 结果与分析

2.1 分级离心制备细胞核、线粒体和细胞质组分

1.5 kg菲律宾蛤仔得到贝肉重量约为500 g,经过分级离心所得到的细胞核组分冻干粉质量为43.77 g,占比约为46.37%;线粒体组分冻干粉质量为16.08 g,占比约为17.03%;细胞质组分冻干粉质量为34.55 g,占比约为36.60%;其中细胞核组分含量最高,线粒体组分含量最低。

2.2 重金属在各组分中的含量、回收率及存在形态

2.2.1 重金属在各组分中的含量

2.2.1.1 铅标准曲线 标准曲线绘制:铅含量标准曲线见图1,标准曲线方程为y=25649x+1568.8,标准曲线决定系数为R2=0.9924。

图1 金属铅标准曲线Fig.1 Standard curve for metallic plumbum

2.2.1.2 锌标准曲线 标准曲线绘制:锌含量标准曲线见图2,标准曲线方程为y=285405x-12153,标准曲线决定系数为R2=0.9919。

图2 金属锌标准曲线Fig.2 Standard curve for metallic zinc

2.2.1.3 镉标准曲线 标准曲线绘制:镉含量标准曲线见图3,标准曲线方程为y=289025x-5159.7,标准曲线决定系数为R2=0.9968。

图3 金属镉标准曲线Fig.3 Standard curve of metallic cadmium

2.2.1.4 重金属在各组分中的含量计算 三种金属在三种组分中的含量测定结果如表2所示,铅和镉在细胞质中含量最高,锌主要存在于细胞核和线粒体中。在各组分中,锌含量均为最高，菲律宾蛤仔是一种富锌食物。锌是人体的必需微量元素,每天摄入10～20 mg是对人体有益的，但是当人体每天摄入锌含量超过40 mg以上,对人体有一定的毒性。与锌元素不同,铅和镉是有毒重金属,由于样品含量以干重计算,铅和镉元素含量相对生鲜贝类较高。

表2 重金属在各组分中的含量(干重,mg/g)Table 2 Contents of heavy metal in each component(dry weight,mg/g)

2.2.2 铅在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态分析 如图4所示,在细胞核、线粒体、细胞质这三种组分中重金属铅主要以硫化物结合态存在,所占的比例分别为75.24%、50.71%和71.29%,其余三种形态均未检出,说明逐级化学提取技术对贝类中铅元素存在形态检测的回收率不高。硫化物结合态是一种易于提取的元素状态，虽然不如可交换态易于入环境,但比有机物结合态活泼,在一定条件下容易释放出来的。所以菲律宾蛤仔各组分中的铅元素相对易于进入环境,易被人体吸收。

图4 铅在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态Fig.4 Different forms of metallic plumbum in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.3 锌在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态分析 如图5所示,菲律宾蛤仔中的重金属锌在四种形态中都存在,其中,在细胞核中锌的残渣态含量最高为34.51%,残渣态重金属在自然条件下释放的可能性极小,能长期稳定存在,不易被生物体富集,说明在细胞核锌元素大部分比较稳定[26]。线粒体中锌的可交换态、硫化物结合态和残渣态含量相近。细胞质中锌主要以可交换态存在,所占比例为35.21%,而交换态是最易被生物体吸收利用的形态,由于生物可利用态的含量最高,所以在细胞质中锌元素大部分比较活跃[27]。说明锌元素在菲律宾蛤仔各组分中存在形态相差较大,细胞核中主要以稳定的残渣态存在,在细胞质中以活泼的可交换态存在。

图5 锌在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态Fig.5 Different forms of metallic zinc in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

2.2.4 镉在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态分析 如图6所示,菲律宾蛤仔中的重金属镉主要以可交换态、硫化物结合态和有机物结合态这三种可利用态金属的形态存在,基本没有以残渣态存在的镉元素,因为残渣态是最稳定的金属存在形态,也叫稳定态[28],所以菲律宾蛤仔各细胞器组分中的重金属镉没有最稳定的稳定态。其中镉在细胞核和线粒体中的形态分布相同,有机物结合态所占比例最高分别为43.03%和40.74%,其次是硫化物结合态,所占比例分别为32.07%和31.57%,可交换态含量较少,分别为23.98%和20.73%。镉在细胞质中存在形态的分布与细胞核和线粒体中的不同,可交换态含量最高,所占比例为47.38%,说明细胞质中的镉元素更易释放到环境中。

图6 镉在细胞核、线粒体、细胞质中的存在形态Fig.6 Different forms of metallic cadmium in the nucleus,mitochondria and cytoplasm

从菲律宾蛤仔各组分重金属存在形态来看,在细胞核和线粒体中,锌和镉主要以有机物结合态和残渣态存在,较稳定,不易释放;在细胞质中,铅、锌和镉主要以可交换态和硫化物结合态形式存在,易于释放到环境中,易于被人体吸收。

2.2.5 逐级化学提取法提取重金属元素回收率 由表3可知,不同重金属元素在不同组分中回收率不一样,重金属元素在不同组分中回收率为50.71%～99.18%。其中Cd回收率最高,回收率为93.04%～99.18%。说明采用逐级化学提取法分析菲律宾蛤仔组分中重金属存在形态是可行的。

表3 重金属元素回收率(%)Table 3 Recovery rate of heavy metal element(%)

3 结论

综上所述,通过差速离心得到细胞质、细胞核、线粒体三种组分,采用原子发射光谱法分析研究三种组分中铅、锌、镉三种重金属含量及金属存在形态。结果表明,采用逐级化学提取法分析菲律宾蛤仔细胞核、线粒体、细胞质三种组分中重金属铅、锌、镉是可行的。菲律宾蛤仔中的重金属铅主要以硫化物结合态存在,在一定条件下还是容易释放到环境中;重金属锌在四种形态中都存在,其中锌在细胞核中的残渣态含量最高,细胞质中锌主要以可交换态存在;菲律宾蛤仔中的重金属镉主要以可交换态、硫化物结合态和有机物结合态这三种形态存在,基本没有以残渣态存在的镉元素。综上,菲律宾蛤仔细胞质中铅、锌、镉三种金属易于释放;细胞核、线粒体中锌、镉两种元素相对稳定。食品中的重金属在与生物成分结合后,会形成多种形态,造成毒性的改变,但在实际的人体代谢过程中,其形态是否改变,还有待进一步研究。