Doehlert设计法结合渴求函数优化党参中多成分的提取工艺

(张掖市质量检验检测研究院,甘肃张掖 734000)

党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch). Nannf.、素花党参CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川党参CodonopsistangshenOliv.的干燥根,主要含有糖类、苷类、甾体类、氨基酸类、挥发油、三萜类、倍半萜内酯类等成分[1-4],具有补中益气、健脾益肺、养血生津的功效[5]。2018年中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的征求意见稿中党参被收录[6],进一步扩大了党参作为一种天然保健植物的应用范围。为更好的拓宽发展党参价值,建立一种对其多成分同时具有较好提取效果的方法尤为必要。

目前,国内在提取工艺优化时常采用响应面法进行试验设计[7-9]。其大部分选择采用Central Composite Design(CCD)设计或Box-Benhnken Design(BBD)设计[10-12],这两种模型试验数多,且对不同影响因素不能采用不同的试验数,对试验设计要求较高。Doehlert设计是近年流行的一种新的设计方式,与其他设计方法,如CCD设计和BBD设计方法相比,具有试验次数相对较少、效率高的特点。4因素试验Doehlert设计仅需21组试验,CCD设计和BBD设计则需要至少25组试验[13]。同时Doehlert设计实验点采用即相邻的正六边型的空间排列[14],各因素的水平数设置不同,可以根据这种性质自由选择所考察因子设计的水平数,将有显著影响的因子水平数设置较多数目,从而使设计更能反映试验本身实际情况。同时结合渴求函数可以多重响应结果进行整体分析,找到最佳工艺条件[15],具有更加实用的意义。

关于党参可溶性糖、紫丁香苷、党参炔苷、浸出物的单独提取工艺优化已有报道[16-20],上述成分同时提取的工艺条件建立及优化未见报道。本文尝试采用Doehlert设计法结合渴求函数,以料液比、提取时间、乙醇浓度、超声功率为考察因素,以党参中可溶性糖、紫丁香苷、党参炔苷、浸出物的含量为考察指标,通过整体渴求函数确定以上4种成分同时提取的最佳工艺条件,为党参进一步开发利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桔梗科植物党参饮片Codonopsispilosula(Franch). Nannf. 张掖德生堂药店;党参炔苷标准物质(批号:18127904,纯度98%)、紫丁香苷标准物质(批号:17112804,纯度98%) 成都普菲德生物技术有限公司;果糖、D-葡萄糖、蔗糖 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;乙醇(分析纯)、甲醇(分析纯，色谱纯) 成都市科隆化学品有限公司;纯净水 华润怡宝饮料中国有限公司。

LC-20AD型高效液相色谱仪(包括SPD-M20A二极管阵列检测器,ELSD-LT II蒸发光散射检测器)、InertSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 日本岛津公司;KH-250DB数控超声波提取器 昆山禾创超声仪器有限公司;CP225D十万分之一电子天平、BS224S万分之一电子天平 赛多利斯上海贸易有限公司;ML503/02千分之一电子天平 梅特勒-托利多国际上海贸易有限公司;HH恒温水浴锅 江苏金坛市中大仪器厂;Venusil HILIC亲水作用色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 党参炔苷与紫丁香苷的含量测定

1.2.1.1 党参炔苷与紫丁香苷标准曲线的绘制 精密称取紫丁香苷标准物质10.64 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成425.6 μg/mL的紫丁香苷储备溶液;精密称取党参炔苷标准物质10.20 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成204.0 μg/mL的党参炔苷储备溶液。分别精密吸取紫丁香苷储备溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 mL,党参炔苷储备溶液1.00、2.00、4.00、5.00、7.00 mL于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,制成每1 mL分别含紫丁香苷4.3、21.3、42.6、85.1、127.7 μg,含党参炔苷20.4、40.8、81.6、102.0、142.8 μg的混合标准曲线工作液。采用C18色谱柱,流动相A为甲醇,B为0.08%磷酸溶液,洗脱方式:梯度洗脱,0～10 min,6%甲醇,10～30 min,6%甲醇～14%甲醇,30～40 min,14%～24%甲醇,40～55 min,24%甲醇,55～61 min,6%甲醇,柱温:35 ℃,采用二极管阵列检测器,检测波长:267 nm,流速:1.0 mL/min,进样量10 μL。以峰面积为纵坐标(A),对照品浓度为横坐标(C)绘制标准曲线。

1.2.1.2 供试品溶液的制备 取党参药材粉末约1 g,精密称定,置100 mL锥形瓶中,按最优提取工艺提取后,放冷,过滤,滤液水浴蒸干,残渣加甲醇溶解,移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,既得测试样品,按“1.2.1.1”色谱条件测定。

1.2.2 可溶性糖的测定

1.2.2.1 可溶性糖标准曲线的绘制 精密称取果糖268.2 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成10.73 mg/mL的果糖储备溶液;精密称取葡萄糖253.3 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成10.13 mg/mL的葡萄糖储备溶液;精密称取蔗糖264.4 mg,置25 mL量瓶中,加10%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成10.58 mg/mL的蔗糖储备溶液。分别精密吸果糖储备溶液1.00、2.00、3.00、3.50、4.00 mL,葡萄糖储备溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL,蔗糖储备溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL量瓶中,加10%甲醇至刻度,摇匀,制成每1 mL分别含果糖1.1、2.2、3.2、3.8、4.3 mg,葡萄糖1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg,蔗糖1.1、1.6、2.1、2.6、3.2 mg的混合标准曲线工作液。采用HILIC亲水作用色谱柱,流动相参考文献[21]后经预试验验证,确定为A为乙腈,B为水,洗脱方式:等度洗脱,15%乙腈-水为流动相,柱温:35 ℃,采用蒸发光检测器,漂移管温度40 ℃,流速:1.0 mL/min,进样量10 μL,可溶性糖以果糖、葡萄糖、蔗糖三种糖总量计。因D-葡萄糖在常温溶液中,会发生异构化现象,实际存在α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖两种异构体[22-23],产生2个色谱峰,比例相对稳定在36∶64,故在分析中以α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖峰总面积作为葡萄糖的计算依据。以峰面积以10为底对数值为纵坐标(Alog),对照品浓度以10为底对数值为横坐标(Clog)绘制标准曲线。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取党参药材粉末约1 g,精密称定,置100 mL锥形瓶中,按最优提取工艺提取后,放冷,滤过,滤液置100 mL量瓶中,用少量提取溶剂分次洗涤容器,滤液滤入同一量瓶中,加溶剂至刻度,摇匀,既得测试样品,按“1.2.2.1”所述色谱条件测定。

1.2.3 浸出物的测量 参照《中国药典》2015年版四部2201浸出物测定法项下“热浸法”[24],精密量取按最优提取工艺提取定容后溶液45 mL,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量,进行计算。

1.2.4 提取工艺的优化 Doehlert设计是由考察的因子-水平数目及其设计矩阵编码值来定义的[25-26],真实值和编码值的关系见下式(1):

式(1)

Doehlert设计所需试验次数N可用公式N=k2+k+C0表示,其中k为所考察因素的数目,C0表示中心点的数目,该数目用来评价模型的试验误差。结合其他文献中对于单一成分的提取方法优化的结果[16-20],综合考虑所涉及的影响因素,确定该试验考察料液比(1∶15～1∶75)、提取时间(10～130 min)、乙醇浓度(28%～100%)、超声功率(180～300 W)4个因素,按照式(1)方程计算编码值。Doehlert设计矩阵选择的各水平数及对应的编码值见表1。

1.3 多重响应的数据处理

渴求函数法是将每个响应值Yi转化为满意度函数di,di∈[0,1]。响应越接近目标值,其满意度越接近1,响应越接近规格限或超出规格限,满意度就越接近0或等于0[27-28]。

取值越大越好的响应,研究人员可以选定一个下界值y-和一个上界值y+,当响应值Yi≤y-时,di=0,认为结果不可接受;响应值Yi≥y+,di=1,认为结果是最接近最佳状况的;响应值Yi介于y+和y-之间时,di按公式(2)进行计算,其中r用来调整渴求函数的形状。

式(2)

取值越小越好的响应,研究人员可以选定一个下界值y-和一个上界值y+,当响应值Yi≤y-时,di=1,认为结果是最接近最佳状况的;响应值Yi≥y+,di=0,认为结果是不可接受;响应值Yi介于y+和y-之间时,di按公式(3)进行计算,其中r用来调整渴求函数的形状。

式(3)

整体渴求函数D:假定某优化过程有m个响应,第i次响应已经选定了一个渴求函数di,其中i=1,…m,则整体渴求函数D可定义为di的加权几何平均数。

式(4)

从公式(4)可得,若任意一个di=0,则D=0,整个过程不可被接受。能使D值最大化的因子水平即为最优化条件。

2 结果与分析

2.1 党参炔苷与紫丁香苷色谱分离

按“1.2.1”项下方法对样品进行处理,并按相应色谱条件进样分析,结果如图1,分离效果良好,说明该色谱条件满足对样品的测量要求。紫丁香苷标准曲线回归方程:A=1976.85C-3196.06,R2=0.9963;党参炔苷标准曲线回归方程:A=11347.2C-18002.6,R2=0.9986。表明紫丁香苷浓度在4.3～127.7 μg/mL范围内、党参炔苷浓度在20.4～142.8 μg/mL范围内响应值与其含量线性良好,可以满足对样品党参炔苷与紫丁香苷的定量测量的需求。

图1 对照品(A)与党参样品(B)色谱图Fig.1 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.紫丁香苷;2.党参炔苷。

2.2 可溶性糖的色谱分离

按“1.2.2”项下方法对样品进行处理,并按相应色谱条件进样分析,结果如图2,分离效果良好,说明该色谱条件满足对样品的测量要求。果糖标准曲线回归方程:Alg=0.7657Clg-4.6882,R2=0.9973;葡萄糖标准曲线回归方程:Alg=0.6981Clg-4.2127,R2=0.9976;蔗糖标准曲线回归方程:Alg=0.7452Clg-4.5575,R2=0.9978,表明果糖浓度在1.1～4.3 mg/mL范围内、葡萄糖浓度在1.0～3.0 mg/mL范围内、蔗糖浓度在1.1～3.2 mg/mL范围内响应值与其含量线性良好,可以满足对样品可溶性糖定量测量的需求。

表1 Doehlert设计矩阵及其编码值Table 1 Doehlert matrix and its coded values for variables

注:括号里的数字为真实值。

图2 对照品(A)与党参样品(B)色谱图Fig.2 Chromatograms of control(A) and Codonopsis pilosula sample(B)注:1.果糖;2.α-D-葡萄糖;3.β-D-葡萄糖;4.蔗糖。

2.3 响应曲面的优化

2.3.1 多重线性回归 响应曲面是通过建立响应值(因变量)与被考察因素(自变量)的函数关系,找到在响应值最大时,自变量的取值范围即最佳试验条件的方法[29-30]。本次试验为4因素试验,待拟合方程为:

式(5)

式中,Yi为响应值;X1～X4为考察因素;β0～β14为相关系数,分别表达了被考察因素的线性效应,二次效应和交互效应。

按“1.2.4”项下表1 Doehlert设计矩阵进行试验,将分析得到的果糖,葡萄糖,蔗糖含量进行加和作为可溶性糖(Y1),与紫丁香苷(Y2)、党参炔苷(Y3)、浸出物(Y4)的含量作为分析结果,通过SAS 8.0进行多元线性回归拟合,通过方差分析判断模型优劣,并进行显著性检验,其中pY1、pY2、pY3、pY4为各响应值预测值。结果如表2。

多元线性回归方程:

表2 响应值实测值与其预测值Table 2 Obtained and predicted values of responses

表3 各因素渴求值及整体渴求值Table 3 Desirability value of each factor and overall desirability value

图3 交互作用响应面Fig.3 Response surface plots of interactions注:a～f分别表示X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4因素交互作用响应面图及等高线图。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)

多元线性回归方程:

式(6)

2.3.2 响应曲面及其等高线 根据模型的回归方程(6),选取交互关系显著的因素,分别对其中2个变量取中值,代入回归方程(6),应用Origin 6.0软件绘制D与其他2个自变量的响应曲面及其等高线图,结果如图3。

通过上图可以直观观察到两个变量之间的交互作用,从响应曲面及其等高线图的形状上可以看出两个变量间的交互作用的强弱,最佳优化剂量条件为曲面顶点附近的区域。可以看出,料液比、提取时间与超声功率间存在明显的相关性,原因可能是因为超声提取中提取溶剂体积对超声的传导有影响,合适的料液比及超声时间,有助于对目标成分的提取;乙醇浓度对于提取率有较为显著的影响,与料液比存在明显的交互关系,与其他因素则交互作用不明显,原因可能是因为乙醇量的增加对于目标成分的溶解性增强,但过高的乙醇浓度会造成样品中多糖的析出,影响整个提取过程。应用LINGO 9.0对整体渴求值D回归方程进行计算,得到相应的自变量最佳取值,得到预测最佳提取结果:料液比1∶60,提取时间70 min,乙醇浓度64%,超声功率240 W。该工艺下提取,预测可溶性糖含量469.51 mg/g,紫丁香苷含量92.32 μg/g,党参炔苷含量332.77 μg/g,浸出物含量69.10%,预测整体渴求值pD为1。结合实际操作的便捷性,确定最佳提取条件:料液比1∶60,提取时间80 min,乙醇浓度70%,超声功率250 W。

表5 优化工艺验证(n=3)Table 5 Validation of optimized process(n=3)

2.4 优化工艺验证

根据“2.3.2”项下最优提取条件,对党参进行提取,得到各成分含量实测值,并求出实测整体渴求值D,并与预测值pD进行比较,由偏差的绝对值大小来判断拟合方程是否能够较好的描述因素与各成分含量的关系,结果如表5。4种目标成分提取率预测值和实测值较为接近,各成分实测渴求值d均在0.85以上,实测整体渴求函数D=0.91,与预测整体渴求值pD偏差9.0%,实测值与预测值偏差较小。

3 结论

本研究应用Doehlert设计结合渴求函数响应曲面优化法,以多个变量为指标,同时对多个影响因素进行优化,考察了料液比、提取时间、乙醇浓度、超声功率4个因素对党参中可溶性糖、紫丁香苷、党参炔苷、浸出物提取效果的影响。试验结果通过渴求函数处理后,采用多元回归对数据进行拟合,再根据回归方程绘制出响应曲面及其等高线图,并结合计算机辅助计算,得到最佳工艺:料液比1∶60,提取时间70 min,乙醇浓度64%,超声功率240 W,预测整体渴求值pD为1。结合实际操作的便捷性,实际操作采用:料液比1∶60,提取时间80 min,乙醇浓度70%,超声功率250 W,该工艺下提取,实测可溶性糖含量434.14 mg/g,紫丁香苷含量86.37 μg/g,党参炔苷含量287.94 μg/g,浸出物含量65.11%,实测整体渴求值D为0.91,实测值与预测值偏差较小。说明模型预测性良好,通过整体渴求函数确定以上4种成分同时提取的最佳工艺条件可行,可以为进一步开发党参价值,拓宽党参应用范围和相关产业发展的提供一定的基础。