华泽兰内生真菌的分离及其抑菌、抗肿瘤活性

张建芬，林 璟，徐好仪，张梦捷

（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015）

华泽兰Eupatorium chinenseL.为菊科泽兰属一年生或多年生草本植物，在我国主要分布于东南部至西南部。传统药理研究表明，华泽兰具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛等功效；现代研究表明，华泽兰富含结构新颖的萜类及黄酮类化合物，具有显著的抑菌和抑制肿瘤细胞活性［1-3］。刘梦元等［4］从华泽兰根中分离得到苯并呋喃类化合物，具有较强抑菌活性；尉小琴等［5］从华泽兰中分离得到泽兰苦内酯类化合物，对人胃癌HGC-27 细胞及小鼠黑色素瘤B16 细胞有显著的细胞毒活性。

Stierle 等［6］从短叶红豆杉Taxus brevifolia中分离到一株能够产生与宿主相同的抗肿瘤代谢产物紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae，而且从药用植物内生真菌中寻找活性成分成为研究的热点，大量的抑菌抗肿瘤活性成分从中分离出来，如紫杉醇、喜树碱、长春新碱、鬼臼毒素等［7］。从泽兰属中药内生真菌中筛选结构新颖、效价高、成药性良好的抑菌、抗肿瘤先导物颇具研究前景，但目前有关华泽兰内生菌产生抑菌、抗肿瘤活性代谢产物的研究尚未见报道。

植物内生真菌能够产生萜类、生物碱类、芳香类、肽类等活性次生代谢产物，可分为聚酮类和非核糖体多肽类化合物，生物合成过程分别是在聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）和非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）的催化下完成［8］。基于PKS 和NRPS 功能基因定向筛选的方法，可以预测菌株可能产生的化合物类型，发现新的聚酮类和非核糖体肽类［9］。

本研究以传统药用植物华泽兰为材料，从植物各部位分离内生真菌，并利用形态学特征结合ITS序列分析进行内生真菌的鉴定；筛选含有PKS 和NRPS 基因的功能菌株，预测其产生次生代谢产物的能力。在此基础上，通过活性筛选的方法从中挖掘出具有抑菌、抗肿瘤活性菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 华泽兰于2016 年9 月至2016年11 月采自杭州西山国家森林公园，采用随机取样法收集健康植株的根、茎、叶、花，装入无菌袋内带回实验室，用于内生真菌的分离。

1.1.2 培养基 采用PDA 培养基进行内生真菌的分离和纯化，采用PDB 培养基进行内生真菌的发酵培养，采用康乃馨叶片培养基（CLA）进行内生真菌的产孢培养。

1.1.3 试剂 真菌基因组DNA 提取试剂盒购于生工生物工程（上海）有限公司；DNA marker 和2×Taq PCR Master mix 均购于宝生物工程（大连）有限公司；PCR 扩增引物合成和PCR 扩增产物测序均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 内生真菌分离 采用组织分离法，参照汪滢等［10］报道。将健康华泽兰的根、茎、叶、花用自来水洗净，切为小段或小片。分别用75% 乙醇和3%次氯酸钠溶液消毒2 min，其间分别无菌水冲洗多次。样品晾干后，切成约1 cm×1 cm 大小，接到PDA 培养基上，28 ℃培养。将最后1 次清洗样品所用无菌水涂布于PDA 平板上作为对照，同样条件下培养、观察，以确保表面消毒彻底。挑取样品切口处长出的菌丝尖端部分，转接至新鲜PDA 培养基上，多次纯化培养，直至获得纯菌株。

1.3 内生真菌鉴定 观察内生真菌的平板菌落形态、菌丝形态和孢子形态，结合《真菌鉴定手册》对分离到的真菌进行表型鉴定［11］，分子生物学鉴定参照相关文献报道的方法［10］。采用CTAB 法提取内生真菌的基因组DNA，以此为模板，ITS1、ITS4 为引物，对内生真菌进行PCR 扩增，在Gen-Bank 数据库中用BLAST 进行比对分析。采用MEGA5 软件的Neighbor-Joining（邻接）法构建内生真菌的系统发育树，Bootstrap 1 000 次进行稳定性检验。

1.4 内生真菌PKS 和NRPS 基因检测和分析 以内生真菌菌株基因组DNA 为模板，按照文献的方法，采用兼并引物KAF1（5′-GARKSICAYGGIACIGGIAC-3′）、KAR1（5′-CCAYTGIGCICCRTGICCIGARAA-3′）和 AUG003（5′-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3′）、AUG007（5′-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRTA-3′）进行PKS、NRPS 功能基因的PCR 扩增［9-10］。PCR 产物经纯化后测序。利用BLASTx 软件将获得的PKS 和NRPS 基因序列转化为氨基酸序列，在线进行序列的同源性比对。

1.5 内生菌发酵培养和活性成分提取 将筛选出的内生真菌接种PDB 发酵培养基（100 mL／500 mL），25 ℃培养7～10 d。活性成分的提取参照文献［10］报道的方法，发酵液用布氏漏斗过滤。发酵滤液用等体积乙酸乙酯萃取3 次，收集萃取液45 ℃下减压浓缩至干，用抑菌、抗肿瘤实验。

1.6 抑菌活性测定 采用滤纸片法。以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli、真菌面包酵母Saccharomyces cerevisiae为指示菌，分别吸取测试样品溶液（以乙酸乙酯稀释至10 mg／mL）15 μL 滴加于空白药敏纸片（直径6 mm）上，将纸片贴到涂布有0.2 mL指示菌菌液（约1×106CFU／mL）的LB 平板上，以乙酸乙酯为空白对照，100 μg／mL 氨苄青霉素为阳性对照，37 ℃培养24 h，测定各样品抑菌圈直径。

1.7 抗肿瘤活性检测 采用MTT 法［5］。以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 和MCF-7 为检测瘤株，完全培养基为阴性对照，阿霉素为阳性对照。细胞在96 孔板中培养后，于490 nm 波长处检测各孔吸光度（A），计算IC50。

2 结果

2.1 内生真菌的分离与鉴定 采用平板分离法，从华泽兰中分离得到内生真菌43 株。根据内生真菌菌株的平板菌落形态特征和显微镜下的形态特征，去重后共得到内生真菌8 株。

在PDA 培养基上，部分菌株的菌落形态见图1、表1。各菌株的菌落形态丰富，有绒毛状、絮状、花瓣状，颜色有白色、粉红色、红色、黑色、绿色等；有的菌株生长较快，菌丝发达，有的生长较慢。图1 表明，EC2、EC7、EC8 菌株生长较快，菌丝发达，迅速长满整个平板，而EC4、EC9 生长较慢。

图1 部分内生真菌形态特征Fig.1 Morphological characteristics on some entophytic fungi

以华泽兰内生真菌的基因组DNA 为模板，以ITS1 和ITS4 为引物，成功扩增了其ITS 区序列，测序结果提交GeneBank 经Blast 比对分析和进化树分析，基于ITS 区序列的系统发育分析见图2。由此可知，8 株菌株分别与Fusarium graminearum、Diaporthesp、Alternaria alternata、Fusarium prolif-eratum、Neofusicoccumparvum、Alternaria tenuissima、Phyllosticta capitalensis的亲缘关系最近（序列相似度98% 以上），将其ITS 区序列提交Genbank，获得登录 号。结合形态学特征和5.8SrDNA／ITS 区序列分析结果，菌株EC102、EC103 鉴定为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum（GeneBank 登陆号MK243482 和MK243483）；菌株EC104 鉴定为间座壳属Diaporthesp（GeneBank 登陆号MK243484）；菌株EC105 鉴定为链格孢属Alternaria alternata（GeneBank 登陆号MK243485）；菌株 EC107 鉴定为层生镰刀菌Fusarium proliferatum（GeneBank 登陆号MK243486）；菌株EC108 鉴定为葡萄座腔菌属小新壳梭孢Neofusicoccum parvum（GeneBank 登陆号MK243487）；菌株EC109 鉴定为细极链格孢Alternaria tenuissima（GeneBank 登陆号MK243488）；菌株 EC111 鉴定为首都叶点霉属Phyllosticta capitalensis（GeneBank 登陆号MK243489）。

表1 内生真菌表型鉴定Tab.1 Phenotype identification of entophytic fungi

图2 内生真菌18S rRNA 序列系统进化树Fig.2 Phylognetic tree of entophytic fungi 18s rRNA sequence

2.2 NRPS 和PKS 基因分析 华泽兰内生菌株的NRPS 和PKS 基因扩增电泳图见图3，可见产物条带在600～700 bp 左右。本研究共得到了3 个NRPS 基因片段，占总量的37.5%；1 个PKS 基因片段，占总量的12.5%。将测序得到的NRPS 和PKS 基因片段用BLAST 比对，结果见表2，可知NRPS 片段与GenBank 中已知NRPS 序列的相似度并不高，仅为70%～83%，表明对分离到8 株菌株的NRPS 和PKS 基因研究较少。因此，对其深入探讨将有可能发现新型聚酮类和非核糖体多肽类化合物。

图3 部分菌株的PKS 和NRPS 基因扩增电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PKS and NRPS gene amplication of some strains

2.3 内生真菌代谢产物的抑菌活性 对分离纯化得到的内生真菌进行液体培养，发酵液经乙酸乙酯提取后，分别得到华泽兰内生真菌乙酸乙酯提取物，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和面包酵母作为指示菌，进行抑菌活性测定，结果见表3，表明菌株EC102、EC103、EC107、EC108、EC111 对供试的4 株菌株都有较好的抑菌效果，占总分离菌株的50%；EC104 和EC109 只对金黄色葡萄球菌有抑菌作用；EC108 和EC109 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到22 mm。

表2 NRPS 和PKS 基因的相似菌株及相似度Tab.2 Similar strains and similarities of NRPS and PKS genes

表3 内生真菌发酵产物的抑菌活性（±s）Tab.3 Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi（±s）

表3 内生真菌发酵产物的抑菌活性（±s）Tab.3 Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi（±s）

2.4 内生真菌代谢产物的抗肿瘤活性 将内生真菌发酵液的乙酸乙酯提取物作用对数生长期的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 进行抗肿瘤试验，结果见表4。显微镜下发现，在96 孔板培养物中具有抑制效果的细胞不同程度脱落、变形甚至凋亡；8株菌株的乙酸乙酯提取物对人乳腺癌细胞株MDAMB-231 均有不同程度的抗肿瘤活性，其中效果最明显的是EC102、EC108，其次是EC107、EC109。然后，将EC102、EC107、EC108、EC109 乙酸乙酯提取物作用对数生长期的人乳腺癌细胞株MCF-7进行抗肿瘤实验，发现它们均有不同程度的抗肿瘤活性，其中效果最好的是EC109。综合抑菌实验和抗肿瘤实验结果，菌株EC102、EC107、EC108、EC109 的代谢产物同时具有抑菌和抗肿瘤活性。

表4 内生菌发酵产物对MDA-MB-231 和MCF-7 的抑制活性（±s）Tab.4 Inhibitory activities of fermentation broth of endophytic fungi to MDA-MB-231 and MCF-7（±s）

表4 内生菌发酵产物对MDA-MB-231 和MCF-7 的抑制活性（±s）Tab.4 Inhibitory activities of fermentation broth of endophytic fungi to MDA-MB-231 and MCF-7（±s）

3 讨论

药用植物具有非常丰富的内生真菌资源，而泽兰属植物内生真菌的研究主要集中在入侵植物紫茎泽兰Eupatorium adenophorum上。本研究首次从华泽兰中分离得到8 株植物内生菌，分析了华泽兰内生真菌的NRPS 和PKS 基因，发现4 个NRPS 基因片段和1 个PKS 基因片段。目前对药用植物内生真菌PKS 和NRPS 的研究相对较少，研究华泽兰中两者有助于发现新的聚酮类和非核糖体肽类化合物。

抑菌活性实验表明，菌株EC102、EC103、EC107、EC108、EC111 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、面包酵母都具有很好的抑菌活性；抗肿瘤活性实验表明，它们对2 种肿瘤细胞株均有不同程度的抗肿瘤活性，其中效果最好的是EC102、EC108 乙酸乙酯提取物，两者代谢产物同时具有较强的抑菌、体外抗肿瘤作用。研究表明，镰刀菌属的次级代谢产物通常会具有较好的抑菌活性和抗肿瘤活性［12-15］，卢围等［13］从小花棘豆中分离到镰刀菌Fusarium proliferatum，能产抗肿瘤活性物质苦马豆 素；郑里翔等［14］发现，镰刀菌Fusariumsp.JN 158 所产色素对MCF-7 乳腺癌细胞有明显抑制作用；刘雷等［15］从川麦冬中分离得到镰刀菌属内生真菌，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等有抑制作用；Ratnaweera 等［16］从仙人掌中分离得到内生真菌Fusariumsp 的代谢产物，具有抑菌作用。但有关葡萄座腔菌属代谢产物抗菌抗肿瘤的研究报道较少，故可进一步研究菌株EC102、EC108 代谢产物中抗菌、抗肿瘤活性成分的组成及其结构，探明这些内生真菌是否产生与宿主华泽兰相同或相似的萜类及黄酮类次级代谢产物，或是新的活性物质，以期为抗肿瘤、抗菌药物的开发提供参考。