聚L-苏氨酸修饰电极法测定特丁基对苯二酚含量

(菏泽学院化学化工学院,山东菏泽 274015)

特丁基对苯二酚是一种合成的酚类抗氧化剂化合物,可使食物的抗氧化稳定性提高3～5倍[1],在干鱼制品、饼干、油炸和膨化食品中广泛使用[2]。TBHQ容易在食物中残留,若过量食用可导致畸形﹑癌症等潜在危害[3-5],因此建立准确快速检测食品中的TBHQ的方法具有重要意义[6]。目前测定TBHQ的分析方法主要有液相色谱法[7-9]、荧光法[10-11]、气相色谱法(GC)[12-14]、电化学法[15-17]。液相色谱法成本检测高,步骤繁琐,而且有机试剂的使用会给环境造成污染;荧光法操作步骤较为复杂,准确度低;气相色谱法检测时间长,有一定的局限性;电化学法具有操作简单,准确度高,检测时间短等优点。氨基酸是构成生物体最基本的物质,具有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)两种官能团,通过电化学方法可以将氨基酸修饰在玻碳电极表面进行药物或食品成分的测定[18-20]。利用聚L-苏氨酸修饰电极测定TBHQ未见文献报道。本文通过电化学循环伏安法制备了聚L-苏氨酸修饰电极,研究了TBHQ在该修饰电极上的电化学行为,在此基础上建立了利用差分脉冲伏安法测定食品中TBHQ的新方法。该方法操作简单,速度快,无环境污染,已在实际食品样品分析中得到验证,具有较高的灵敏度和较高的准确度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-苏氨酸 购自天津市光复精细化工研究所;特丁基对苯二酚 购自阿拉丁试剂有限公司;不同pH的磷酸盐缓冲溶液(sodium hydrogen phosphate-citric acid buffer solution,PBS)均用Na2HPO4和NaH2PO4配制;薯片 济南达利食品有限责任公司;其他试剂 均为分析纯。

CHI-660D电化学工作站 上海辰华仪器有限公司;KQ-100型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;MT红外灯 中山市古镇鑫煌灯饰电器厂;78HW-1数显恒温磁力搅拌器、SYZ-550石英亚沸高纯水蒸馏器 金坛市江南仪器厂;SHZ-CB循环水式三抽头多用真空泵 河南省豫章实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 修饰电极最佳聚合条件的优化 将玻碳电极在有三氧化二铝悬浮液的麂皮上抛光,依次用体积分数50%硝酸、无水乙醇、二次蒸馏水超声清洗30 s,每次取出后均用二次蒸馏水冲洗,晾干,放入 1.00×10-3mol·L-1的L-苏氨酸溶液中,以裸电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为对电极,对制备修饰电极的聚合底液、聚合电位、扫描速度、聚合高低电位进行选择优化。

聚合底液pH:固定聚合底液中苏氨酸的浓度为1.00×10-3mol·L-1,聚合电位范围为-1.7～2.4 V,扫描速度为40 mV/s,扫描段数为6,改变聚合底液pH进行实验,测得TBHQ氧化峰电流最大时即为最佳聚合底液pH。

聚合段数:固定聚合底液中苏氨酸的浓度为1.00×10-3mol·L-1,pH为5.8,电位范围为-1.7～2.4 V,扫描速率为40 mV/s,分别改变聚合段数为2、4、6、8、10、12进行实验,测得TBHQ氧化峰电流最大时即为最佳聚合段数。

聚合扫描速率:固定聚合底液中苏氨酸的浓度为1.00×10-3mol·L-1,pH为5.8,电位范围为-1.7～2.4 V,聚合段数为6,分别改变扫描速度为20、40、60、80、100、120 mV/s进行实验,当测得的TBHQ氧化峰电流最大时,测得扫描速率为最佳。

聚合高低电位:固定聚合底液中苏氨酸的浓度为1.00×10-3mol·L-1,pH为5.8,扫描速度为40 mV/s,聚合段数为6,低电位为-1.5 V,分别改变高电位为1.8、2.0、2.2、2.4、2.6进行实验,当测得的TBHQ氧化峰电流最大时所对应的电位为最佳聚合高电位;按照相同的方法固定聚合高电位为2.4 V,改变低电位分别为-1.3、-1.5、-1.7、-1.9、-2.1 V进行实验,当测得的TBHQ氧化峰电流最大时所对应的电位为最佳聚合低电位。

1.2.2 聚L-苏氨酸修饰电极的制备 将预处理好的玻碳电极浸入1.00×10-3mol·L-1L-苏氨酸溶液中(pH5.8),在-1.7～2.4 V电位范围内静止状态下,以40 mV/s的扫描速率循环扫描6段后取出,用二次蒸馏水淋洗电极表面,晾干,即得聚L-苏氨酸修饰电极。

1.2.3 特丁基对苯二酚测定条件优化 以修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为对电极,分别改变特丁基对苯二酚测定的pH、扫描速度、高低电位进行实验,当测得特丁基对苯二酚氧化峰电流最大时,即为最佳测定条件。

测定底液pH:在1.00×10-3mol·L-1TBHQ溶液中,固定扫描速度为100 mV/s,电位范围为-0.4～0.8 V,改变溶液的 pH分别为5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0进行实验。

测定扫描速度:在pH5.8 PBS中,TBHQ浓度为1.00×10-3mol·L-1,固定电位范围为-0.4～0.8 V,改变扫描速度分别为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400 mV/s进行实验。

测定高低电位:在pH5.8 PBS中,TBHQ浓度为 1.00×10-3mol·L-1,固定扫描速度为100 mV/s,低电位为-0.3 V,分别改变高电位为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V进行实验,当测得的TBHQ氧化峰电流最大时,所对应的电位为高电位;固定高电位为0.8 V,改变低电位分别为-0.8、-0.6、-0.4、-0.2、-0.0 V进行实验,当测得的TBHQ氧化峰电流最大时所对应的电位为最佳低电位。

1.2.4 TBHQ测定方法 将一定量TBHQ、pH5.8 PBS加入到电解池中,以修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,固定扫描速度为100 mV/s,电位范围为-0.4～0.8 V进行循环扫描,记录峰电位和峰电流。实验所得循环伏安曲线研究TBHQ在聚L-苏氨酸修饰电极上的电化学行为。

1.2.5 样品处理方法 称取10.0010 g样品薯片粉碎,加入10 mL无水乙醇进行溶解,超声分散10 min后,用真空泵抽滤,得到滤渣,在滤渣中再加入10 mL无水乙醇,重复处理三次,合并滤液,于25 mL容量瓶中制得样品溶液。分别取样品溶液0.60 mL,平行测定6次。

1.3 数据处理

实验数据从CHI-660D电化学工作站中导出后,用Origin软件进行分析和数据处理。

2 结果与讨论

2.1 聚L-苏氨酸修饰电极最佳聚合条件

实验结果表明,聚合底液pH、聚合段数、扫描速度、高低电位对修饰电极的灵敏度及性能有一定的影响。通过实验优化了制备L-苏氨酸修饰电极的最佳聚合条件,如图1所示,当固定聚合底液中苏氨酸浓度为1.00×10-3mol·L-1,pH5.8,电位范围为-1.7～2.4 V,扫描速率为40 mV/s,聚合段数为6时,制备的PLTE/GCE测定TBHQ的氧化峰电流值最大。

图1 聚L-苏氨酸修饰电极最佳聚合条件Fig.1 Optimization of preparation conditions of PLTE/GCE注:A为聚L-苏氨酸修饰电极最佳聚合pH,B为聚L-苏氨酸修饰电极最佳聚合段数, C为聚L-苏氨酸修饰电极最佳扫描速率,D、E为聚L-苏氨酸修饰电极最佳高低电位。

图2 L-苏氨酸聚合的循环伏安曲线Fig.2 Cyclic voltammeograms curves of L-threonine in polymerization process注:1,2,3分别表示L-苏氨酸连续循环聚合的 第1、2、3周,2段为一周,共6段。

2.2 聚L-苏氨酸修饰电极的聚合循环伏安曲线

图2为L-苏氨酸在最佳聚合条件下的聚合循环伏安曲线。由图2可知,随着扫描段数的增加,氧化峰和还原峰电流也随之增加,但增加的幅度有所减小,这表明在电极表面L-苏氨酸发生了聚合反应,并可观察到在电极表面有深蓝色的膜存在。

2.3 特丁基对苯二酚在聚L-苏氨酸修饰电极上的电化学行为

图3为在相同实验条件下聚L-苏氨酸修饰电极测定空白溶液(a)、裸电极测定特丁基对苯二酚溶液(b)、聚L-苏氨酸修饰玻碳电极测定特丁基对苯二酚(c)的循环伏安曲线,由图3可知,特丁基对苯二酚在裸电极上的氧化还原峰电位(Epa,Epc)和氧化还原峰电流(ipa,ipc)分别为:Epa=0.41 V,Epc=0.03V,ipa=-1.39 μA,ipc=1.05 μA,而在聚L-苏氨酸修饰电极上氧化峰电位负移,还原峰电位正移,而且氧化还原峰电流增大较为明显,分别为Epa=0.26 V,Epc=0.13 V;ipa=-5.10 μA,ipc=6.10 μA,氧化峰电流约为裸电极上电流的4倍,表明了聚L-苏氨酸修饰电极对特丁基对苯二酚电化学氧化具有很好的催化作用,使氧化还原反应的电子传递速率加快,ipa/ipc=0.84,为准可逆反应。

图3 TBHQ在空白溶液(a)、玻碳电极(b)、 聚L-苏氨酸修饰电极(c)上的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of TBHQ in blank solution(a)and at GCE(b),the PLTE/GCE(c)

2.4 特丁基对苯二酚测定条件的选择

2.4.1 底液pH的影响 测定底液的pH对特丁基对苯二酚的氧化峰的峰电流和电位都有一定的影响。固定其他条件不变,只改变TBHQ底液的pH进行实验,结果如图4所示,pH在5.8～8.0范围内,当pH增大时,特丁基对苯二酚的氧化峰电位Epa出现负移,这说明特丁基对苯二酚的氧化还原过程有质子参与。氧化峰电位Epa与pH之间存在着线性关系:Epa=0.41-0.051pH,r=0.9996;实验结果还表明,TBHQ氧化峰电流在pH5.8～8.0的范围内随pH增大而减小,当pH等于5.8时TBHQ的峰电流最大,因此选择pH5.8的缓冲溶液作为实验测定底液。

图4 1.0×10-3 mol·L-1 TBHQ在聚L-苏氨酸 修饰电极上的随pH变化的循环伏安曲线Fig.4 Cyclic voltammograms of 1.0×10-3 mol·L-1 TBHQ at different pH values on the PLTE/GCE注:扫描速度为100 mV/s,从a到 f的pH为: 5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0;内插图为氧化峰电位 与测定底液pH的关系曲线。

2.4.2 扫描速率的影响 固定其他条件不变,只改变扫描速率对TBHQ进行实验,图5可表明,当扫描速率在20～400 mV/s内变化时,氧化峰电流随着扫描速率的增加而增大。氧化峰电流与扫描速率呈线性关系,线性方程为ipa=0.13-1.57×10-4ν,相关系数r=0.9972,说明TBHQ在聚L-苏氨酸修饰电极上进行的电极反应过程为吸附过程。当扫描速率大于100 mV/s时,会降低方法的灵敏度。故选择100 mV/s作为特丁基对苯二酚测定的扫描速率。

图5 1.00×10-3 mol·L-1 TBHQ在L-苏氨酸 修饰电极上不同扫速下的循环伏安曲线Fig.5 Cyclic voltammograms of 1.00×10-3 mol·L-1 TBHQ at PLTE/GCE注:从a到t的扫速分别为:20、40、60、80、 100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、 300、320、340、360、380、400 mV/s;内插图为TBHQ 在修饰电极上的氧化峰电流值随扫描速度的变化曲线。

2.4.3 高低电位的影响 实验测定的高低电位对TBHQ在L-苏氨酸修饰电极上的氧化峰电流有一定的影响。从图6可以看出,在固定其他条件不变的情况下,当高电位为0.8 V时,特丁基对苯二酚在聚L-苏氨酸修饰电极上的氧化峰电流最大,因此选择0.8 V为本实验测定的最佳高电位。同样固定高电位为0.8 V,其他条件不变,改变低电位进行实验。当低电位为-0.4 V时,TBHQ在聚L-苏氨酸修饰电极上的氧化峰电流最大,因此选择-0.4 V为本实验的测定最佳低电位。

表1 干扰实验(n=3)Table 1 Interference experiment(n=3)

综上所述,特丁基对苯二酚在聚L-苏氨酸修饰电极上的最佳测定电位范围是-0.4～0.8 V。

图6 TBHQ在L-苏氨酸修饰电极上的最佳高低电位Fig.6 The optimal high and low potential of TBHQ at PLTE/GCE注:A为TBHQ在L-苏氨酸修饰电极上的最佳高电位;B为TBHQ在L-苏氨酸修饰电极上的最佳低电位。

2.5 干扰实验

对2.00×10-5mol·L-1的TBHQ进行干扰实验。结果如表1所示,在相对误差允许的范围为±5%内,50倍的Cu2+、Cd2+、Na+、K+、Ca+、Mg2+等离子对实验结果均无影响。因此,该方法有很好的选择性,可应用于实际样品的测定。

2.6 工作曲线和检出限

在最佳实验条件下,分别用循环伏安法和差分脉冲伏安法对TBHQ进行测定,结果表明TBHQ氧化峰电流与其浓度范围内存在良好的线性关系,循环伏安法测得其线性方程为ipa=3.41×10-7+0.019c(mol·L-1),相关系数r=0.9978,线性范围为6.0×10-7～1.00×10-5mol·L-1,检出限为4.7×10-7mol·L-1;差分脉冲伏安法(图7)测得其线性方程为ipa=9.18×10-8+0.034c(mol·L-1),相关系数r=0.9994,线性范围为2.0×10-7～2.0×10-5mol·L-1,检出限为8.6×10-9mol·L-1。可见差分脉冲伏安法线性范围较宽,灵敏度较高,因此选择差分脉冲伏安法测定TBHQ。

图7 最佳实验条件下不同浓度的TBHQ 在聚L-苏氨酸修饰电极上的差分脉冲伏安曲线Fig.7 Differential pulse voltammetrys of TBHQ at PLTE/GCE at different concentrations注:a～h的浓度为:0.2、0.6、1.0、2.0、6.0、8.0、10.0、 20.0 μmol·L-1;内插图为TBHQ的 浓度与氧化峰相应电流的关系曲线。

2.7 重现性和稳定性

对聚L-苏氨酸修饰电极测定TBHQ的重现性和稳定性进行了实验。用循环伏安法在优化的实验条件下对TBHQ进行平行测定6次,结果如图8所示,测得值间的相对标准偏差为1.1%,表明该修饰电极重现性较好。对于测定结束后,将修饰电极置于一定量的缓冲溶液中(pH5.8)中循环扫描至无峰,并置于空白溶液8 d后,再对特丁基对苯二酚进行测试,测试值为第一次测试值的98.9%,表明该修饰电极稳定性良好。

图8 TBHQ在聚L-苏氨酸修饰电极上的 平行测定6次循环伏安曲线图Fig.8 Cyclic voltammograms of TBHQ at PLTE/GCE by parallel determination for six times

2.8 样品分析与回收率

按照最佳实验条件,对每个样品进行6次平行测定,结果见表2。回收率在98.5%～102.5%之间,结果可以满足对食品样品的测定要求,准确度均较高。与气相色谱法进行了比较[14],两种方法回收率相接近,说明本实验方法准确度可靠,结果满意。

表2 样品中 TBHQ 的回收率测定结果(n=6)Table 2 Recovery measurements of TBHQ in samples(n=6)

3 结论

制备了聚L-苏氨酸修饰电极,研究表明TBHQ在修饰电极上的电化学反应为准可逆吸附过程,而且有质子参与,TBHQ氧化峰电流与其浓度在2.0×10-7～2.0×10-5mol·L-1范围内呈良好的线性关系,r=0.9994,检出限为8.6×10-9mol·L-1。建立了测定食品中TBHQ的新方法,该电极可用于薯片等油炸食品中TBHQ的含量的测定,回收率为98.5%～102.5%之间,结果准确度较高,从而为食品中添加剂的检测提供技术支持,并且对以氨基酸为修饰材料的电化学传感器器件的发展以及食品分析新方法的发展具有参考价值,但氨基酸聚合物电化学催化机理还需进一步探讨。