功能化磁性纳米材料在磷酸化肽富集中的应用

熊芳芳, 江丹丹, 贾 琼

(吉林大学化学学院, 吉林 长春 130012)

蛋白质磷酸化是一种由激酶和磷酸酶共同调控的可逆性翻译后修饰。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程能够改变蛋白质的构象和表面电荷分布,从而对酶活性和蛋白质之间的相互作用产生影响[1,2]。因此,蛋白质磷酸化与各种细胞过程密切相关,包括细胞代谢、生长、增殖、分化以及凋亡[3,4]。在真核细胞中,最常见的蛋白质磷酸化位点位于酪氨酸、苏氨酸及丝氨酸残基上,其比例约为1∶200∶1 800。据估计,在真核细胞中大约存在70万个潜在的磷酸化位点[5,6]。然而蛋白质磷酸化过程是动态的,只有比例很小的位点在特定时刻同时被磷酸化。因此,磷酸化蛋白质的含量比较低(仅仅占细胞内蛋白质总含量的1%～2%),并且酶解磷酸化蛋白质后产生的磷酸化肽的丰度值更低[7]。蛋白质磷酸化的调节是一个非常复杂的级联反应过程,其异常的调节会导致人类许多疾病,如糖尿病、白血病、癌症和老年痴呆症等[8,9]。因此,分析研究蛋白质磷酸化过程是一个具有挑战性且意义重大的课题,近年来也成为蛋白质组学的研究热点之一。

目前,基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的鉴定技术是识别磷酸化蛋白质/肽的一种强有力的工具。然而由于内源性磷酸化肽的总含量和离子化效率十分低,通过MS很难直接检测到复杂的生物样品中的磷酸化肽[10]。因此,发展高选择性和高灵敏的分离富集策略和技术,对磷酸化蛋白质的鉴定是十分必要的。近年来,出现了各种针对磷酸化肽的分离方法,包括离子交换色谱法[11]、免疫亲和法[12]、固定化金属离子亲和色谱(IMAC)法[13,14]、金属氧化物亲和色谱(MOAC)法[15,16]等。为了将亲和材料从所处的介质中与靶分子有效地分离开来,将纳米材料磁化可以简化分离步骤和缩短分离时间。磁性纳米复合材料以其独特的功能和可分离性在磷酸化肽的富集方面受到越来越多的关注[17]。

磁性纳米粒子作为一种新型的纳米材料诞生于20世纪80年代末,发展的速度十分迅速。它在外界磁场的存在下可以展现出良好的磁响应性[18,19]。许多纳米粒子都具有磁性,最为常见的有两大类:第一类主要是金属及其合金,包括Fe、Co、Ni、Fe-Co及Fe-Ni合金等;第二类主要是MeFe2O4(Me=Mn、Co、Ni)、γ-Fe2O3及Fe3O4等。其中,Fe3O4由于具有生物相容性好、制备简便等特点,被广泛地应用于许多领域,如载药、核磁共振、分离富集等[20]。此外,裸露的磁性纳米粒子具有很高的化学活性,在空气中很容易被氧化,通常会导致磁性和分散性的丧失。因此,对于许多应用、开发保护策略以化学稳定磁性纳米粒子在合成过程中或合成后的降解是至关重要的。结合磷酸化肽的富集策略,功能化磁性纳米材料既体现了功能化分子或基团对磷酸基团的亲和性,又具有良好的超顺磁性,便于实现简便快速的磷酸化肽分离过程。功能化磁性纳米材料在磷酸化肽的富集中有着举足轻重的地位,在下文中将着重介绍磁性纳米粒子的功能化及在磷酸化肽的富集中的应用。主要分为以下几类:基于金属氧化物-磷酸基团相互作用的磁性富集材料、基于金属离子-磷酸基团相互作用的磁性富集材料、基于静电相互作用/氢键的磁性富集材料。

1 磁性纳米粒子的制备

近年来,许多科研工作者都致力于制备Fe3O4纳米粒子的研究。常用的方法包括共沉淀法[21,22]、热分解法和/或还原法[23,24]、微乳液合成[25,26]、水热合成[27,28]、溶胶-凝胶和多元醇合成[29,30]、微波等离子体合成[31]、声化学反应[32]、冷冻干燥[33]、流动注射合成[34]、电喷雾合成[35]、激光热解技术[36]等,都可以用来制备高质量的磁性纳米粒子。共沉淀法、热分解法和微乳液法是合成粒径小于30 nm的常用方法,而水热法和自组装法一般适用于合成粒径大于100 nm的磁性粒子。可以通过采用不同的制备条件和方法,对生成的Fe3O4纳米粒子进行调控,包括表面形貌、粒径尺寸等,以满足应用要求。

2 磁性纳米粒子的功能化

磁性纳米粒子的一个不可避免的问题是它们在较长时间内的内在不稳定性,主要表现在两方面:(1)分散性损失,即小的纳米粒子易于聚集形成大的粒子以降低表面能量;(2)失去磁性,由于化学活性高,裸磁性纳米粒子很容易在空气中氧化,特别是Fe3O4和γ-Fe2O3纳米粒子。因此,开发一种合适的保护策略在后续应用过程中或之后的损伤是至关重要的。目前,已经有不同的方法被报道以实现磁性纳米粒子的功能化,包括原位涂层和合成后涂层。常用的功能化材料包括如下几类:(1)表面活性剂和小分子[37-40]: -OH、-COOH、-NH2、-SH,这些基团可以通过附着不同的生物活性分子进行进一步修饰,以适应不同的应用场合;硅烷作为一种小分子,常被改性和赋予官能化端基到裸磁性纳米粒子表面,3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、氨基苯基三甲氧基硅烷(APTS)和巯基丙基三乙氧基硅烷(MPTES)试剂是最常见的硅烷化试剂并用于锚定-NH2和-SH。(2)聚合物[41-47]:包括聚天冬氨酸、多糖、海藻酸盐、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚(D,L-丙交酯)、壳聚糖和聚甲基丙烯酸甲酯。(3)二氧化硅[48,49]:是一种用于基础研究和生物应用的经典而重要的复合材料。由于二氧化硅层可以屏蔽磁性离子之间的磁偶极引力,因此二氧化硅涂层可以增强溶液中的分散性。(4)碳[50,51]:碳涂层提供了一个有效的氧化屏障,并防止腐蚀磁芯材料。其中,氧化铁纳米粒子核表面的亲水碳涂层具有较好的分散性和稳定性。

功能化修饰的磁性纳米粒子的结构组成可以主要归为以下4类:核-壳型、壳-核型、壳-核-壳型、镶嵌型,目前制备的比较多的两类是核-壳型和镶嵌型。

(1)核-壳型:核-壳型结构以磁性纳米粒子为核,将磁核外部功能化修饰上无机或有机材料作为壳层,以提高其对目标分析物的特异性。一般会将硅烷化试剂作为核-壳型磁性纳米材料的壳层,通过硅烷化试剂与磁性Fe3O4纳米粒子的Fe原子形成化合键,可引入氨基、苯基或者巯基等其他基团,然后将其与表面活性剂、离子液体、金属氧化物、大环化合物和多孔骨架材料等其他材料进行结合[52-55]。

Zhao等[56]制备了表面活性剂修饰的磁性纳米粒子,用于环境水样中酚类化合物的移除,该方法得到的浓缩倍数为1 600。Zhou等[57]合成了具有双特异性识别位点的磁性聚离子液体材料,并与石墨炉原子吸收光谱联用,富集检测痕量贵金属Au、Pd、Pt,所得到的回收率为88.3%～116.3%。Hong等[58]在磁性二氧化硅包覆层表面修饰TiO2-NiO后将其用于磷酸化肽的富集,结合LC-MS/MS检测,从HeLa细胞提取物中鉴定出972个特异性磷酸化肽。Li等[59]将共价有机骨架材料修饰在磁性氨基包覆层表面,并将其用于水中双酚类物质的富集,结合紫外可见分光光度计检测,对双酚A和双酚AF的饱和吸附量分别达到了160.6和236.7 mg/g。

(2)镶嵌型:镶嵌型是指以有机或无机材料为主体,将Fe3O4镶嵌在其表面。主体材料的比表面积通常比较大,且易于被功能化修饰上特定基团。其中,石墨烯具有蜂巢状的晶格结构、二维的纳米结构、较高的比表面积,是目前使用十分广泛的主体材料[60-64]。对石墨烯进行氧化反应可以得到氧化石墨烯,其含有的羟基、环氧基及羧基等基团便于下一步的修饰改性。

Shao等[65]采用原位共沉淀法制备了磁性葫芦[6]脲/氧化石墨烯复合吸附剂,将该复合材料用于从水溶液铀离子的去除,饱和吸附量达到122.48 mg/g。Wang等[66]采用自组装方法制备了共价有机骨架材料功能化的磁性石墨烯生物复合材料(MagG@COF-5)。所制备的材料亲水性超强,可以有效地识别N-糖肽。MagG@COF-5复合材料在N-糖肽分析中表现出优异的性能,检测限低至0.5 nmol/L,尺寸排阻效果好,可重复利用性好。

3 功能化磁性亲和材料在磷酸化肽富集中的应用

3.1 基于金属氧化物-磷酸基团相互作用的磁性富集材料

金属氧化物是根据路易斯酸碱理论实现对磷酸化肽富集的。基于金属氧化物-磷酸基团相互作用的磁性富集材料通常由Fe3O4磁核和具有亲和能力的金属氧化物壳层组成的。2005年,Chen等[67-69]将金属氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3和Ga2O3)包覆于磁球表面用于磷酸化肽段的富集。首先利用正硅酸乙酯或硅酸钠在Fe3O4磁球表面包覆一层SiO2壳形成磁性硅球,而后通过水解将钛酸丁酯、锆酸丁酯、三异丙醇铝及三异丙醇镓包覆于硅球上,最终形成金属氧化物包覆的磁球[70-72]。这些磁球用于磷酸化肽段的富集均取得了较好的结果。

为了提高吸附材料的比表面积,研究者们将二维材料引入了磷酸化肽的富集研究中,如石墨烯等。Li等[73]设计合成了二元金属氧化物包覆的多巴胺(PD)修饰的磁性石墨烯(magG)复合材料magG/PD/(Zr-Ti)O4,并应用于磷酸化肽的富集研究。所制备的复合物比表面积大,生物相容性好,超顺磁性强,对磷酸化肽的亲和能力高。对比了magG/PD/ZrO2、magG/PD/TiO2以及它们的复合材料的富集效率,结果表明复合材料具有较高的灵敏度(1 μg/L)和选择性(β-酪蛋白与牛血清蛋白的质量比达1∶8 000)。此外,以小鼠脑组织为实际样品,进一步证明了该材料对磷酸化肽具有高的捕获能力。

随着二维材料及其复合材料的制备技术不断提高,更多新型的二维材料不断地被开发出来,如钛酸盐、铌酸盐和钛铌酸盐纳米片等。这些二维材料比表面积比较大,且路易斯酸位点十分丰富,为磷酸化钛的富集提供了可能性。Li等[74]通过简单的阳离子交换方法制备了包埋有Fe3O4纳米粒子的铌钛酸盐纳米复合材料,并用于磷酸化肽的捕获和同位素标记。在该材料中,Fe3O4不仅提供了磁响应性能,而且还保持了铌钛酸盐纳米片的二维结构。合成的Fe3O4-TiNbNS由于具有较高的活性表面积、丰富的路易斯酸位点和优良的磁响应性,在磷酸化肽的捕获和同位素标记反应中表现出比块状金属氧化物及层叠状氧化物更优越的灵敏度、选择性和吸附容量。通过结合原位同位素标记法,成功地检测了白血病患者血清中异常调节的磷酸化肽。

3.2 基于金属离子-磷酸基团相互作用的磁性富集材料

近年来,磁性纳米粒子结合IMAC应用于磷酸化肽富集研究的文献较多。通常由Fe3O4纳米粒子作为磁核,中间为螯合剂(如亚氨基二乙酸(IDA)、氨三乙酸(NTA)、壳聚糖或其他有机高分子聚合物等),外壳为金属离子(如Zn2+、Fe3+、Ce4+、Zr4+、Ti4+等),形成核-壳结构的磁性IMAC杂化材料[75-78]。例如,Li等[79]制备了Fe3+螯合的二氧化硅磁性微球,首先通过溶剂热反应制备磁性微球,然后用正硅酸乙酯修饰,形成二氧化硅包裹的磁性微球。随后,用3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)与IDA反应得到的硅烷偶联剂(GLYMO-IDA)对二氧化硅磁性微球进行接枝,最后将Fe3+螯合在微球的表面上得到微球。该微球实现了对磷酸化肽简单、高效、特异性地富集。

Wang等[80]合成了一种新型的磁性IMAC材料,将透明质酸(HA)和壳聚糖(CS)逐层修饰到Fe3O4@SiO2纳米粒子表面形成亲水性壳层,最后连接上Ti4+。所制备的Fe3O4@SiO2@(HA/CS)10-Ti4+材料具有超顺磁性、亲水性及高Ti4+含量的特点,对磷酸化肽实现了高选择性的捕获。结合MS检测,实现了检出限低(0.5 nmol/L)、吸附容量高(100 mg/g)、回收率高(85.45%)和快速磁分离(10 s)。

Chen等[81]报道了Ga3+螯合的三磷酸腺苷(ATP)功能化的磁性纳米粒子(MNPs)对磷酸化肽的富集研究。制备的Ga3+-ATP-MNPs成功地用于大鼠肝线粒体的磷酸化蛋白质/肽的分析,识别到了158种磷酸化蛋白质、193种磷酸化肽及331个磷酸化位点,其中54.4%的磷酸化肽具有多个磷酸化位点。Ga3+-ATP-MNPs对多磷酸化肽的高特异性可能是由于协同了ATP的强亲水性与Ga3+的强亲和能力。此外,Ga3+-ATP-MNPs实现了直接板上富集后进行MALDI-TOF MS分析,检测限低至30 pmol/L。

3.3 基于静电相互作用/氢键的磁性富集材料

在磁性材料表面引入带正电荷的亲水性修饰基团,可使材料通过静电相互作用/氢键吸附带负电荷的磷酸基团,从而实现对磷酸化肽的富集。因此一些富含氨基的化合物,如聚乙烯亚胺、1,6-己二胺、胍基硅烷化试剂等被修饰到Fe3O4的表面,用以捕获磷酸化肽。Chen等[82]制备了聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米粒子,该材料在pH 3～11之间携带正电荷,可以特异性地从蛋白质混合物中捕获磷酸化肽,所需富集时间仅为1 min。Zhang等[83]利用一锅法制备了1,6-己二胺修饰的磁性纳米粒子,该材料依次实现了选择性捕获糖肽和磷酸化肽。以多肽/磷酸化肽/糖肽摩尔比为10∶1∶1的混合物为分析样品,对糖肽和磷酸化肽的回收率分别为76%和88%。此外,肽段序列覆盖率从25.6%增加到51.8%,相当于模型蛋白质(去唾液酸胎球蛋白)的102%。这些新识别到的磷酸化肽和糖肽提供了额外的序列信息,有利于蛋白质的后续分析。Deng等[84]制备了胍基功能化的超顺磁性纳米微球以3-胍丙基三乙氧基硅烷(GDN)为功能化单体,对Fe3O4@SiO2进行改性得到Fe3O4@SiO2@GDN。所制备的材料能够高选择性地捕获磷酸化蛋白质,对标准磷酸化蛋白质具有较高的结合能力,其中对卵清蛋白和β-酪蛋白的吸附容量分别为78.8和59.6 mg/g。Xiong等[85]在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的Fe3O4微球上引入胍基,制备了具有可调控特异性的亲和材料。通过简单地调节缓冲液成分,实现了对单/多磷酸化肽的可调控富集,取得了较高的富集能力(200 mg/g)、检测灵敏度(0.5 nmol/L)及回收率(91.30%)。

4 结论与展望

通过高效、简单、快速和方便的磁分离方式,将磁性亲和探针应用于实际生物样品中磷酸化肽的分离富集,可以取得良好的效果。然而,严格可控的形状和大小分布的磁性离子的形成仍然是一个挑战,不同条件下氧化铁的形成机理还有待研究。还需要解决诸如生物相容性、毒性、体内和体外靶向效率以及功能化离子的长期稳定性等问题。因此,开发和设计出新型的、多功能的亲和纳米探针材料应用于磷酸化肽的富集[86-90],通过二维结构化、介孔化、多位点化等手段来增加亲和探针的比表面积以及丰富结合位点,进一步提高磷酸化肽的选择性、检测灵敏度和吸附容量,依旧是该研究领域的重要发展方向。随着人们深入研究和探索功能化磁性纳米探针材料对磷酸化肽的富集原理和相互作用机制,发展一些具有富集效果好和效率高、应用性强的功能化磁性纳米材料,将会大大推进磷酸化蛋白质组学的研究进展,也会在生物医学中磷酸化肽生物标记物的检测中有很大的应用前景。