基于磁性共轭微孔聚合物的超高效液相色谱-串联质谱法测定果蔬中7种有机磷杀虫剂

蔡伟秋, 雷皓宇, 胡玉玲, 李攻科

(中山大学化学学院, 广东 广州 510275)

有机磷杀虫剂作为广谱农药被广泛应用于农业生产种植[1,2],但因不完全降解而残留于水果、蔬菜和环境水体中,会对环境和人体健康造成潜在危害[3]。我国国家标准[4]中规定了有机磷类杀虫剂在水果和蔬菜中的最大残留限量,如甲基谷硫磷(APM)0.05～2 mg/kg、亚胺硫磷(PSM)0.05～10 mg/kg、三唑磷(TZP)0.1～0.2 mg/kg、辛硫磷(POX)0.05～0.1 mg/kg、倍硫磷(FT)0.05～2 mg/kg、苯线磷(FMP)0.02 mg/kg和伏杀硫磷(PSL)1～2 mg/kg。有机磷杀虫剂的检测方法包括气相色谱-质谱法[5,6]、气相色谱法[7,8]、液相色谱法[1]、液相色谱-串联质谱法[9],其中液相色谱-串联质谱法兼具有液相色谱的分离能力与质谱的离子鉴定能力,是农产品中有机磷杀虫剂的有效检测手段。

果蔬中有机磷杀虫剂残留量低,采用固相萃取技术分离富集可提高检测方法的灵敏度。分子印迹固相萃取[10-12]、固相微萃取[13,14]、磁固相萃取[7,15]、搅拌棒吸附固相萃取[16,17]等技术在农药残留的分析中应用广泛。磁固相萃取技术以磁性或磁化材料作吸附剂,通过外加磁场实现分离,可解决富集材料难以从样品溶液中完全分离的问题,并实现循环使用。磁性共轭微孔聚合物(conjugated microporous polymers, CMPs)是一种由碳-碳键和苯环组成的具有宽共轭体系的磁性聚合物,具有稳定性强、多孔共轭结构和强磁性等特点[18,19]。共价成键方式使磁性CMPs能在酸、碱、有机溶剂、潮湿及高温等环境下稳定存在。在外加磁场下,磁性CMPs可从样品中便捷分离并循环利用。

本课题组报道了一种由亚苯基亚乙炔基构成、内嵌Fe3O4的三维共轭网状磁性CMPs材料[20]。修饰亚苯基亚乙炔基的Fe3O4与1,3,5-三溴苯、1,3,5-三乙炔苯反应[21],单体上3个活性位点使亚苯基及亚乙炔基密集分布于三维网状结构,能有效增强材料对共轭结构农药的吸附作用,实现便捷磁分离。磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs具有强共轭体系、超顺磁性、能富集共轭结构农药并实现磁分离的特点。本文以三唑磷、亚胺硫磷、辛硫磷、甲基谷硫磷、倍硫磷、苯线磷、伏杀硫磷7种有机磷杀虫剂为研究对象,基于磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs富集果蔬中有机磷杀虫剂残留,与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用,建立了果蔬中有机磷杀虫剂残留的准确、灵敏的分析新方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-MS 8030超高效液相色谱-串联质谱仪(日本Shimadzu公司); DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南巩义予华仪器公司); 2XZ(S)-2型旋片式真空泵(上海德英照明公司); GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱(上海博迅实业公司); BG-06C型超声波清洗机(广州邦杰设备公司); DKZ-1型恒温振荡摇床(江苏余姚仪器公司)。

六水合氯化铁、四水合氯化亚铁(沈阳化学试剂厂);双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)、3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO,纯度为97%)、三唑磷、亚胺硫磷、辛硫磷标准品(纯度≥99%,北京百灵威科技公司); 3-氨基苯乙炔(APE)、1,3,5-三溴苯、1,3,5-三乙炔苯、碘化亚铜、三溴苯、三乙炔基苯、甲基谷硫磷、倍硫磷、苯线磷、伏杀硫磷标准品(纯度≥99%,上海阿拉丁公司);硅酸四乙酯、乙酸乙酯、三乙胺、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷、乙腈、乙醚、甲醇、乙醇、甲苯(色谱纯,广州化学试剂厂);实验用水为超纯水;蔬菜水果购自广州市菜市场、超市、水果店。

称取适量有机磷杀虫剂标准品,用乙腈溶解,配成100 mg/L的单标准储备溶液,于4 ℃保存。分别准确移取适量上述单标准储备溶液,以超纯水定容,通过逐级稀释法配制成混合标准溶液(苯线磷、三唑磷0.1 μg/L,甲基谷硫磷、亚胺硫磷、倍硫磷0.5 μg/L,伏杀硫磷、辛硫磷1.5 μg/L),于4 ℃保存,临用时稀释成所需浓度。

1.2 磁性CMPs材料的合成

磁性CMPs材料的合成方法参考本课题组前期工作[20]。亚苯基亚乙炔基修饰处理的Fe3O4用乙醇洗涤5次,于150 ℃真空干燥。通过3次冷冻-抽吸-解冻循环将含有60 mg 1,3,5-三溴苯、58 mg 1,3,5-三乙炔苯和50 mg亚苯基亚乙炔基修饰处理的Fe3O4的24 mL DMF反应体系进行脱气。向混合液中加入20 mg双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)、10 mg碘化亚铜、0.2 g三乙胺、2 mL甲苯-水(1∶1, v/v),于60 ℃下密封搅拌24 h。磁分离获取产物,依次用水、甲醇、丙酮、THF和二氯甲烷对材料进行简单洗涤,随后再用水、甲醇和THF分别搅拌材料36 h对其进行完全的清洗,干燥得到磁性CMPs材料。

表 1 7种有机磷杀虫剂的保留时间和质谱参数

* Quantitative ion.

1.3 样品前处理

准确称量50.0 g果蔬样品,切成碎块并加入30 mL乙腈,在匀浆机上高速匀浆2 min,超声提取20 min,将样品过滤后,用氮气吹干乙腈溶剂,随后用水将提取物复溶至100 mL,加入20 mg磁性CMPs材料,振荡萃取吸附10 min,磁分离后加入1.0 mL乙酸乙酯,超声8.4 min,洗脱液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行UPLC-MS/MS检测。

1.4 分析条件

色谱柱:Shim-pack xr-ODS柱(75 mm×2.0 mm, 2.2 μm);柱温:30 ℃;流动相:A为乙腈,B为10 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)乙酸);流速:0.5 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 30%A; 2.0～3.0 min, 30%A～80%A; 3.0～6.0 min, 80%A～90%A。进样量:2 μL。

离子源:电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;雾化气流速:3 L/min;干燥气体流速:10 L/min;加热气体流速:10 L/min;接口温度:300 ℃;碰撞气:高纯氮气;检测模式为多反应监测(MRM)模式,分别检测5次,取平均值。7种有机磷杀虫剂的保留时间和其他质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 磁性CMPs材料的研制

磁性CMPs材料由修饰亚苯基亚乙炔基的Fe3O4与1,3,5-三溴苯、1,3,5-三乙炔苯反应合成。Fe3O4纳米颗粒经正硅酸乙酯水解形成富有-OH的表面层,在硅烷偶联剂作用下形成环氧丙基官能团,该基团与APE表面氨基反应而使Fe3O4纳米颗粒接上亚苯基亚乙炔基。改性Fe3O4纳米粒子通过Sonogashira反应与三溴苯和三乙炔苯交叉偶联,获得由亚苯基和亚乙炔基组成的三维网络结构的磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs材料。该材料具有更高密度的共轭基团,可增强体系共轭强度,通过π-π堆积和疏水作用有效吸附具有芳香族共轭结构的有机磷杀虫剂,并在外加磁场下实现便捷分离。

2.2 超高效液相色谱-串联质谱条件的选择

2.2.1流动相的选择

流动相是影响信号响应稳定性的关键因素。7种有机磷杀虫剂在弱酸性环境中能稳定存在,因此将水相组成确定为10 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)乙酸)。分别选用乙腈和甲醇作为有机相,与上述水相组成流动相进行考察。结果表明,乙腈作为有机相时7种有机磷杀虫剂的信号稳定。

2.2.2质谱条件优化

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法测定目标化合物。通过流动注射法获取7种有机磷杀虫剂的母离子,在ESI+模式下分别进行母离子扫描,确定其准分子离子并优化碰撞电压和碰撞能量,确定子离子,优化后的质谱参数见表1。

2.3 磁固相萃取条件优化

2.3.1萃取溶剂的选择

考察了不同萃取溶剂(水、甲醇、DMSO和DMF)对有机磷杀虫剂峰面积的影响。结果如图1a所示,7种有机磷杀虫剂在采用水作为萃取溶剂时响应的峰面积最大。由于水的极性最强,作为萃取溶剂时有机磷杀虫剂更易被材料吸附;甲醇与水结构近似,极性比水弱;DMSO和DMF的不饱和双键使有机磷杀虫剂与萃取剂间的分子间作用力更强,不利于磁性CMPs材料对杀虫剂的吸附。因此选择水作为最优萃取溶剂,萃取效率高,且具有环保无毒等优点。

2.3.2萃取时间的选择

实验考察萃取时间分别为10、15、20和25 min时,7种有机磷杀虫剂的萃取效果。结果如图1b所示,在10～20 min时,杀虫剂响应的峰面积随萃取时间的增加而增强;在20 min后峰面积趋于稳定。因此实验选择20 min为萃取时间。

2.3.3洗脱剂的选择

实验考察洗脱剂(乙酸乙酯、丙酮和乙醚)对7种有机磷杀虫剂萃取效果的影响。结果如图1c所示,当选用乙酸乙酯作为洗脱剂时,杀虫剂响应的峰面积最大。乙酸乙酯和丙酮含有的不饱和双键能削弱吸附剂与杀虫剂的π-π作用,洗脱效率更高,但丙酮极性高于乙酸乙酯,对有机磷杀虫剂的洗脱效果稍弱。因此选择乙酸乙酯为最优洗脱剂。

图 1 (a)萃取溶剂、(b)萃取时间、(c)洗脱剂和(d)洗脱剂体积对7种有机磷杀虫剂峰面积的影响(n=5)Fig. 1 Effects of (a) extraction solvents, (b) extraction time, (c) elution solutions and (d) elution solution volumes on the peak areas of the seven organophosphorus insecticides (n=5)DMSO: dimethyl sulfoxide; DMF: N,N-dimethylformamide.

2.3.4洗脱剂体积的选择

实验考察不同洗脱剂体积(0.8、1.0、2.0和3.0 mL)对7种有机磷杀虫剂萃取效果的影响。结果如图1d所示,在1.0～3.0 mL范围内,目标物响应的峰面积随洗脱剂体积的增大而减小。当洗脱剂体积为0.8 mL时,材料无法充分洗脱目标物,信号响应强度弱。因此选择1.0 mL为最优洗脱剂体积。

2.4 方法学考察

配制7种有机磷杀虫剂的混合标准溶液,采用优化后的萃取条件,经UPLC-MS/MS测定后,以目标物定量离子的峰面积(y)为纵坐标,对应的质量浓度(x, ng/L)为横坐标绘制标准曲线。结果表明,7种有机磷杀虫剂在线性范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999。

在空白样品中添加较低浓度的混合标准溶液进行富集萃取,以3倍和10倍信噪比分别计算方法的检出限和定量限。结果如表2所示,7种有机磷杀虫剂的检出限和定量限分别为0.12～5.0 ng/kg和0.40～17 ng/kg。

与文献报道的有机磷农药检测方法进行对比(见表3),本方法具有更低的定量限,基于磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs材料进行分离富集,结合超高效液相色谱-串联质谱法可显著提高分析灵敏度。

表 2 7种有机磷杀虫剂的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, ng/L.

表 3 与其他有机磷杀虫剂检测方法的比较

表 4 实际样品中7种有机磷杀虫剂的含量

图 2 (a)实际样品和(b)标准溶液中7种有机磷杀虫剂的色谱图Fig. 2 Chromatograms of the seven organophosphorous insecticides in (a) real samples and (b) a standard solution 1. APM; 2. PSM; 3. FMP; 4. TZP; 5. FT; 6. PSL; 7. POX. The matrices of peaks 1-7 in Fig. 2a were green pepper, grape, potato, citrus, chinese cabbage, spinach and leaf mustard, respectively. The mass concentrations of peaks 1-7 in Fig. 2b were 0.01, 0.02, 0.001, 0.001, 0.01, 0.02 and 0.01 μg/L, respectively.

2.5 实际样品检测

采用本文建立方法分别测定青椒、西红柿、黄瓜、葡萄、土豆、草莓、柑橘、苹果、樱桃、大白菜、菠菜和芥菜12种果蔬样品中有机磷杀虫剂残留。结果表明,7种有机磷杀虫剂分别在不同的样品中检出,检出含量为1.1～500.0 ng/kg(见表4)。7种有机磷杀虫剂在不同样品中的色谱图与混合标准溶液的色谱图(见图2)。结果表明，方法高效、准确、灵敏,适用于果蔬中有机磷杀虫剂的定量分析。

对柑橘、苹果、梨、娃娃菜和生菜5种空白果蔬样品分别取低、中、高3个水平进行加标回收试验,每个加标水平进行5次平行测定。结果如表5所示,7种有机磷杀虫剂的加标回收率为80.8%～125%, RSD(n=5)小于6%,表明方法的准确度与精密度能满足果蔬样品中有机磷杀虫剂的定量分析要求。

表 5 果蔬中7种有机磷杀虫剂的回收率(n=5)

3 结论

本研究基于磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs固相萃取剂,结合超高效液相色谱-串联质谱建立了果蔬中7种有机磷杀虫剂的分析方法。磁性聚亚苯基亚乙炔基CMPs材料具有强共轭体系和顺磁性,在富集杀虫剂后能通过外加磁场便捷分离。磁固相萃取剂对7种有机磷杀虫剂分离富集效果良好,并可有效降低杂质对超高效液相色谱分离造成的影响。该方法简便、准确、灵敏,在痕量农药分析中具有良好的应用前景。