通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠Wnt信号通路DKK1、β-catenin表达的影响

柳玉佳 王莘智 吴伊莹 廖亮英 范伏元

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是侵蚀性关节炎的慢性、进行性发展，可发生于任何年龄[1]。目前RA的发病机制尚不清楚，基本病理表现为滑膜炎和异常增生的血管翳，关节软骨和骨的进行性破坏，最终引起关节畸形和功能丧失[2-3]。因此，早期、规范诊治是控制RA发生发展，改善预后的根本[4]。Wnt/β-catenin信号通路被称为经典Wnt信号通路，与RA的炎症和骨破坏密切相关[5]。通痹颗粒为我院的内部制剂，实验研究证实其可以缓解佐剂性关节炎大鼠的关节炎症[6]，但具体机制尚未完全明确。本研究拟通过观察Wnt/β-catenin信号通路重要的负性调节因子Dickkopf 1（DKK1）和关键蛋白β-连环蛋白（β-catenin）的表达情况，探讨通痹颗粒对RA模型——胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠滑膜组织异常增生的调控机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SD雌性大鼠，SPF级，体重200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证编号：SCXK（湘）2009-0004，于湖南中医药大学实验中心室完成动物饲养。

1.2 药物与试剂 通痹颗粒，药物组成：当归30 g、黄芪15 g、白芍10 g、川芎10 g、全蝎5 g、僵蚕10 g、乳香10 g、没药10 g、桂枝10 g、黄柏10 g、甘草3 g，颗粒剂，用量为中草药的等效剂量，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科提供，并由煎药室制备浓缩为含生药2 g/mL。雷公藤多苷片，浙江得恩德药业有限公司生产，国药准字：Z33020422，规格：10 mg×50片。牛Ⅱ型胶原、不完全弗氏佐剂，购自美国Chondrex公司；DKK1 ELISA试剂盒、β-catenin ELISA试剂盒，购自武汉菁禾生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 YLS-TA型足趾容积测量仪（山东医学科学院设备站）；石蜡包埋机、切片机（德国Leica公司）；光学显微镜、图像分析仪（日本OLYMPUS公司）；酶标仪（美国Biotech公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 40只大鼠适应性饲养7 d后，随机分为空白组、模型组、阳性药物组和通痹颗粒组，每组10只。除空白组外其余各组予牛Ⅱ型胶原诱导CIA大鼠模型，空白组注射等量生理盐水。造模方法参考文献[7]，将牛Ⅱ型胶原蛋白冰浴完全溶解在冰醋酸中，并用不完全弗氏佐剂乳化，制备牛Ⅱ型胶原，通过皮内注射0.2 mg于大鼠尾根部进行初始免疫，7 d后同前法以0.1 mg进行增强免疫。初次免疫后第21天进行造模评判，大鼠关节炎指数评分≥6分，则为造模成功。本研究造模过程顺利，二次免疫后评判均成功造模。

2.2 给药方法 成功造模后按人鼠体表面积换算药物剂量进行灌胃给药。通痹颗粒组：予通痹颗粒浓缩液灌胃，每日20 g/kg。阳性药物组：雷公藤多苷片溶于生理盐水，每日灌胃剂量约为2.4 mg/kg。空白组和模型组予等量生理盐水灌胃。各组均每日灌胃1次，连续14 d。

2.3 指标检测 所有大鼠于治疗前和治疗第7、14天时观察关节病变情况，进行关节炎指数评分，测量关节肿胀度。灌胃第15天通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死，于右后足踝关节剥离滑膜用于滑膜组织病理学检查，腹主动脉采血用于血清学指标检测。

2.3.1 关节炎指数评分 参照Wood氏的关节炎评估标准[6]，根据关节病变程度按照5级量表法进行评分：关节不红不肿计为0分，只有小趾关节红肿为1分，仅为趾关节和足跖出现红肿计为2分，脚踝以下的所有足爪肿胀为3分，全部足爪均出现红肿计为4分。对每个关节的积分累积即为关节炎指数，最大值16分。分别于治疗前和治疗第7、14天进行评估。

2.3.2 关节肿胀度测量 采用足跖肿胀度测量仪对大鼠左后足踝关节进行评估，通过足跖容积的变化程度来估测大鼠的关节肿胀度。分别于治疗前和治疗第7、14天进行测量。

2.3.3 苏伊红（HE）染色法观察滑膜病理形态 滑膜组织在10%福尔马林液中固定24 h，脱钙，自流水冲洗，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片，在200倍光学显微镜下观察滑膜组织形态。

2.3.4 酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清DKK1、β-catenin水平 全血静置1 h，以离心半径10 cm，3 000 r/min的速度离心20 min，取出上层血清ELISA法测定DKK1、β-catenin水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件，计量资料采用（-x±s）表示，采用独立样本t检验和单向ANOVA分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠治疗前后关节炎指数评分比较 治疗前和治疗第7、14天，除空白组外其余各组大鼠关节炎指数评分均明显高于空白组（P＜0.01）；治疗第7、14天，各治疗组大鼠关节炎指数评分均明显低于本组治疗前和模型组治疗同时期（P＜0.05），治疗第14天指标明显低于治疗第7天（P＜0.05），阳性药物组与通痹颗粒组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后关节炎指数评分比较（±s） 单位：分

表1 各组大鼠治疗前后关节炎指数评分比较（±s） 单位：分

注： 与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05 ；与本组治疗前比较，#P＜0.05；与本组治疗第7天比较，★P＜0.05。

组别 动物数/只 治疗前 治疗第7天 治疗第14天空白组 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 10 8.60±1.07** 9.10±0.85** 9.80±0.21**阳性药物组 10 8.70±1.13** 7.30±0.41**▲# 5.30±0.27**▲#★通痹颗粒组 10 8.60±0.98** 7.10±0.37**▲# 5.10±0.32**▲#★

3.2 各组大鼠造模前及治疗前后关节肿胀度比较 治疗前和治疗第7、14天，除空白组外其余各组大鼠关节肿胀度均明显高于空白组（P＜0.05）；治疗第7、14天，各治疗组大鼠关节肿胀度均明显低于本组治疗前和模型组治疗同时期（P＜0.05），治疗第14天指标明显低于治疗第7天（P＜0.05），阳性药物组与通痹颗粒组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠治疗前后关节肿胀度比较（±s） 单位：mL

表2 各组大鼠治疗前后关节肿胀度比较（±s） 单位：mL

注： 与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与本组治疗前比较，#P＜0.05；与本组治疗第7天比较，★P＜0.05。

组别 动物数/只 治疗前 治疗第7天 治疗第1 4天空白组 1 0 1.6 6±0.3 8 1.6 3±0.3 5 1.6 5±0.1 7模型组 1 0 2.1 3±0.5 6* 2.1 5±0.3 7* 2.0 9±0.2 3*阳性药物组 1 0 2.1 4±0.4 7* 1.9 2±0.4 3*▲# 1.7 8±0.1 5*▲#★通痹颗粒组 1 0 2.1 4±0.5 1* 1.8 9±0.3 5*▲# 1.7 4±0.1 4*▲#★

3.3 各组大鼠关节滑膜病理学情况比较 空白组滑膜组织未增厚，滑膜细胞排列整齐，未观察到血管增生及炎症细胞浸润；模型组滑膜组织明显增厚，细胞排列紊乱，血管明显增生，大量炎症细胞浸润；阳性药物组滑膜组织略微增厚，细胞排列较整齐，血管轻度增生，小量炎症细胞浸润；通痹颗粒组滑膜组织略微增厚，滑膜细胞排列较有序，血管增生不明显，可见少量炎性细胞浸润。提示阳性药物组和通痹颗粒组CIA大鼠病变关节的滑膜病理组织结构均有一定的好转，通痹颗粒组稍优于阳性药物组。见图1。

图1 各组大鼠滑膜组织病理学情况（HE，×200）

3.4 各组大鼠血清DKK1、β-catenin表达比较 与空白组比较，其余各组大鼠血清DKK1、β-catenin均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组血清DKK1、β-catenin水平明显降低（P＜0.05）；阳性药物组和通痹颗粒组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清DKK1、β-catenin表达比较（±s）

表3 各组大鼠血清DKK1、β-catenin表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数/只 DKK1/（ng/mL） β-catenin/（pg/mL）空白组 10 3.53±1.27 23.41±4.28模型组 10 9.36±1.22* 29.23±5.15*阳性药物组 10 6.15±1.18*▲ 26.04±4.42*▲通痹颗粒组 10 5.97±1.09*▲ 25.89±3.77*▲

4 讨论

RA的主要病理变化是炎症和滑膜的异常增殖，其特征在于血管新生、关节软骨和骨损伤。Wnt/β-catenin信号通路是细胞增殖分化的关键调节途径，与RA的发病机制密切相关。DKK1为通路上游的重要负性调节因子，β-catenin为通路的关键蛋白，与Wnt/β-catenin信号通路调控作用密切相关。肖光华等[8]发现Wnt通路参与了CIA大鼠的发病机制，可能通过上调DKK1、下调骨保护素诱导关节炎症。XIAO等[9]实验证实，RA患者滑膜细胞中β-catenin的表达增加，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制滑膜炎性可能是RA治疗的关键。SANTOS等[10]发现，Wnt通路抑制剂DKK1的过度表达与RA骨质破坏有关，可以作为RA关节破坏的生物标志物。MATZELLE等[11]研究证实，RA骨侵蚀的修复发生在炎症消退的环境中，与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。因此，研究Wnt/β-catenin信号通路在RA炎症及骨破坏的双向调节作用是非常重要的[12]。

RA可归属于中医学“历节病”“鹤膝风”等范畴。《证治汇补》曰：“久则须分气血虚实，痰瘀多少治之。”本课题组根据前期研究[13]及临床观察，提出了RA的“虚”“痰”“瘀”论治，并研制出具有“益气养血，化痰逐瘀”功效的通痹颗粒。方中重用当归为君，养血活血、止痛利筋；黄芪补气益卫，以资气血生化之源，白芍敛阴养血、缓急止痛，二者共为臣药；川芎行气活血，和血而不滞血；全蝎、僵蚕治风化痰、散结通经；乳香、没药通气活血，不至耗伤气血；桂枝温通经脉、散寒止痛，使痰瘀易散；黄柏味苦性寒，能清热燥湿、泻火解毒、消肿祛腐，方中取反佐之意以清郁久所化之热；甘草为使，调和诸药。凡RA具有气血亏虚、痰瘀互结者均可使用。实验研究证实，通痹颗粒可缓解佐剂性关节炎大鼠的关节炎症，并且对下丘脑-垂体-肾上腺轴及血清白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）具有一定的调节作用，但具体机制尚未完全明确[6]。

本研究结果显示，通痹颗粒治疗后，CIA大鼠的关节炎症指数和关节肿胀度明显降低，提示通痹颗粒可以改善CIA大鼠的关节炎症。滑膜病理检查提示通痹颗粒治疗后CIA大鼠关节滑膜组织及血管增生均明显改善，血清DKK1、β-catenin水平均明显降低，提示通痹颗粒对CIA大鼠的治疗作用可能是通过对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用实现的。通痹颗粒通过Wnt/β-catenin信号通路下调DKK1、β-catenin表达，从而防止异常血管增生和滑膜炎症细胞浸润，可能是通痹颗粒治疗CIA的机制之一。但因Wnt/β-catenin信号通路相关因子的表达受多重因素影响，其具体的作用机制尚需进一步研究。此外，我们临床发现通痹颗粒对RA并发的抑郁症也有一定的缓解作用，下一步拟通过临床及实验研究观察通痹颗粒对RA并发抑郁症的干预作用，并探索其可能的机制。