猪小肠抗菌肽对小鼠迟发型变态反应的影响试验

2020-02-17刘小龙赖隆永马绍伟陈盛勇叶盛聪余勋信

福建畜牧兽医 2020年1期

刘小龙赖隆永马绍伟陈盛勇叶盛聪徐磊杨慧余勋信

(1.派生特(福州)生物科技有限公司福州 350500；2.福建农业职业技术学院福州 350303)

抗菌肽又称宿主防御肽，可以从动物、植物、微生物中获得，有研究者利用乙酸浸提法从猪小肠中成功地提取到抗菌肽类物质[1-3]。抗菌肽不仅可以由嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生，而且在黏膜和皮肤的上皮细胞、枝状细胞和角蛋白细胞中也可以产生。可以为组成型表达，也可以由前炎症因子和体外病原诱导产生[4]。

迟发型变态反应（Delayed type hypersensitivity，DTh），属Ⅳ型细胞介导的迟发型变态反应，根据其机理，利用一些小分子半抗原类物质使动物体致敏，致敏后让动物体再次接触这类抗原，一段时间后引发动物体局部的变态反应。二硝基氟苯（2,4-dinitro-1-fluorobenzene，DNFB）是一种半抗原，将其涂抹腹壁皮肤致敏后，4～7 d后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。

本研究通过小鼠迟发型变态反应试验，反映猪小肠抗菌肽的药理活性，以期了解猪小肠抗菌肽对细胞免疫水平的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物健康昆明小鼠，体重（20±2）g，雌、雄各半，由福建医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂仪器二硝基氟苯（DNFB）、麻油、生理盐水、丙酮（均为国药集团化学试剂有限公司）；猪小肠抗菌肽（多肽含量为0.7 mg/mL）由派生特（福州）生物科技有限公司提供；JA2603B型电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）。

1.3 溶液配制 1%DNFB溶液配制：称定50 mg DNFB，置于洁净的干燥小瓶中，将预先配好的5 mL丙酮麻油溶液（丙酮∶麻油＝1∶1）倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封，混匀后，用注射器通过瓶盖取用。

1.4 试验方法

1.4.1 猪小肠抗菌肽稀释取猪小肠抗菌肽（多肽含量为0.7 mg/mL），用生理盐水稀释成质量浓度为0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL 的猪小肠抗菌肽注射液。

1.4.2 试验分组与设计将30只健康昆明小鼠随机分成5组，每组6只。其中，试验组1、2、3和4分别皮下注射浓度为 0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL及原液0.7 mg/mL猪小肠抗菌肽注射液；对照组与空白组分别皮下注射生理盐水（见表1）。各组小鼠均每日注射一次，注射剂量按每克体重小鼠注射0.01 mL计算，连续注射7 d。

连续注射7 d后将小鼠腹部皮肤脱毛，范围约3 cm×3 cm，试验组和对照组均用1%DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏，而空白组不做任何处理。致敏5 d后，试验组、对照组及空白组均用1%DNFB溶液10 μL均匀涂抹于所有小鼠的右耳（两面），24 h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左、右耳壳，用打孔器取下直径8 mm的耳片，称量重量。直径8 mm的左右耳片重量之差（肿胀度）表示迟发型变态反应的程度，即：肿胀度＝右耳片重量（mg）-左耳片重量（mg）。

1.4.3 数据统计与分析使用统计软件对数据进行单因子方差分析，用LSD法进行多重比较，结果采用平均值±标准差表示。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

由表 2 可知，试验组 1、2、3、4，对照组和空白组肿胀度分别为 9.4 mg、9.6 mg、10.1 mg、10.1 mg、7.8 mg、0.7 mg。试验组 1、2、3、4 肿胀度分别与对照组和空白组差异显著（P＜0.05）；对照组肿胀度与空白组差异显著（P＜0.05）；试验组 1、2、3、4 组间差异不显著（P＞0.05）；由此表明，猪小肠抗菌肽对小鼠迟发型变态反应具有增强作用，说明猪小肠抗菌肽能够增强机体的免疫应答水平。

表1 试验设计

表2 猪小肠抗菌肽注射液对小鼠迟发型变态反应的影响

3 讨论

抗菌肽是生物在长期进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子，具有选择性效应和分子质量小、无抗原性等特点，被认为是天然免疫的重要介质，在宿主对抗病原入侵的免疫防御中起着极其重要的作用[5]。大量研究结果证明，作为宿主防御系统的重要组成成分，活性肽在体内除了能以直接杀死病原菌的方式起作用外，更多的时候是作为免疫效应分子来启动、调节宿主免疫防御体系，从而促进免疫功能来消除感染，保护宿主免受病原微生物侵害[6-8]。在迟发型变态反应中，接触性迟发型变态反应是由体外的一些小分子半抗原类物质如油漆、重金属、化妆品等引发的过敏现象，这类半抗原类物质进入机体后与体内蛋白质结合成完全抗原，由朗格汗斯细胞提呈给T细胞，使T细胞激活成效应T细胞，再次接触这类抗原时出现过敏现象。试验组 1、2、3、4 小鼠肿胀度（9.0 mg、9.5 mg、10.1 mg、10.1 mg）均显著（P＜0.05）高于对照组（7.8 mg）和空白组（0.7 mg），不同浓度的猪小肠抗菌肽对小鼠耳肿胀度也有一定程度的影响。目前，将猪小肠抗菌肽应用到动物身上的研究甚少，而猪小肠抗菌肽是否有可以增强动物疫苗的使用效果，相关研究还在继续进行。