漳州部分猪场PCV-2血清学调查

黄朝勇 漳州市龙文区农业农村局 福建漳州 363000

PCV-2是猪圆环病毒病（Porcine circovirus diseases，PCVD/PCVAD）、仔猪断乳综合症（PMWS）、猪繁殖障碍、猪呼吸系统综合征等疾病的主要病原体之一[1]。有报道表明，PCV-2在猪的免疫细胞内复制可引发免疫细胞凋亡，导致机体免疫能力受阻，造成机体抵抗能力减弱。其他病毒或细菌，在这个时候入侵机体，形成混合感染，或造成继发感染，进而造成猪的死亡[2]。

PCV-2为无囊膜的单股环状DNA病毒，由衣壳蛋白和核酸构成，是目前最小的动物病毒之一。PCV-2的天然宿主是猪，对猪具有极强的感染性，但在其他动物体内检测不到该病毒的抗体[3]。

2000年，郎洪武等首次报道了我国也存在猪圆环病毒 2 型（Pig round ring disease type 2，PCV-2）[4]。2005年，郭站军等对福州市发病猪群病料进行PCR检测，结果证实福州养猪场存在PCV-2感染，而且普遍。有报道指出，PCV-2在中国猪群中广泛存在，给中国养猪业带来了严重的经济损失[5]。

目前猪场主要通过全病毒灭活苗和亚单位疫苗进行免疫，其中主要是使用亚单位疫苗[6]。由于亚单位疫苗均是选用Cap蛋白作为抗原，因此，利用非Cap蛋白包被的ELISA进行的抗体检测，可以有效地区分野毒感染；而以Cap蛋白包被的间接ELISA进行的抗体检测则可以反映疫苗的免疫情况。因此，本研究利用基于PCV-2的非结构蛋白ORF3蛋白作为抗原的间接ELISA和购买的以Cap蛋白包被的间接ELISA方法对漳州市已经用PCV-2亚单位疫苗免疫的部分规模猪场进行血清学调查，以了解PCV-2流行情况。

1 材料与方法

1.1 材料 抗原（ORF3原核表达蛋白）、酶标板、待检血清、酶标二抗（羊抗兔）、包被液、终止液（2 mol/L硫酸溶液）、洗涤液、封闭液（含5%BSA的PBST缓冲液）、邻苯二胺（OPD）等。基于Cap蛋白的间接ELISA试剂盒。

1.2 仪器 超净工作台、微量移液器、酶标仪等。

1.3 血清 从漳州部分猪场收集的已采用PCV-2亚单位疫苗免疫的血清250份。

1.4 基于ORF3的间接ELISA方法

1.4.1 包被抗原 用包被液1:40倍稀释PCV-2 ORF3抗原，加入酶标板，每孔100 μL，置于4℃冰箱包被过夜。

1.4.2 封闭 倒掉包被液，并于干净的纱布上拍干，用含有吐温的PBS缓冲液洗涤，共洗涤3次，3 min/次。 分别加入 200 μL封闭液/孔 （含 0.05%BSA的PBST缓冲液），在湿盒内，37℃条件下封闭3 h；然后用含有吐温的PBS缓冲液洗涤，共洗3次，3 min/次，拍干。

1.4.3 加待检血清 以1:4 000倍稀释待检血清，分别加入100 μL/孔，放置湿盒内，37℃条件下孵育2 h；然后用含有吐温的PBS缓冲液洗涤，共洗3次，3 min/次，拍干。

1.4.4 加二抗 在每孔中分别加入以1:5 000倍稀释的羊抗兔溶液200 μL，放置湿盒内，37℃条件下储存2 h；然后用含有吐温的PBS缓冲液洗涤，洗3 次，3 min/次，拍干。

1.4.5 终止反应 取10 mL柠檬酸钠缓冲液，加OPD和3%双氧化氢溶液100 μL，置湿盒37℃避光显色10 min后加2 mol/L终止液100 μL，终止反应。

酶标仪检测：选择波长A490 nm，以空白孔调零，当P/W≧2.1时，判定为阳性。

1.5 基于Cap的间接ELISA方法 按说明书进行。

2 结果与分析

试验共检测了漳州市部分规模化猪场送检的250份血清，使用Cap蛋白作为包被抗原测得阳性230份，阳性率92%；使用ORF3蛋白作为包被抗原测得阳性130份，阳性率52%（见表1）。可见，漳州市猪场虽然有进行PCV-2亚单位疫苗免疫，但是仍然存在PCV-2野毒感染较高的情况。

表1 抗体检测结果

3 讨 论

第一个有记载的PCV-2病例是1991年。1998年，Allan分离出PCV-2病毒。之后，Meehan等确定了PCV-2的全部基因序列[7]。再后来是PCV-2感染与其他细菌或病毒性疾病的混合感染相继出现。郎洪武等研究人员利用ELISA技术，对我国7个省（市）的500多头猪进行了20多次血清检测，结果显示血清阳性率为42.9%，表明PCV-2在我国各地都有流行。曹胜波等研究表明PCV-2在中国养猪场广泛存在。

有研究表明，PCV-2可破坏免疫细胞，造成免疫应答能力减弱，可能会导致其他病毒或者细菌混合感染和继发感染，从而给养猪业带来了巨大的经济损失[8]。继猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）后，PCV-2已被列为世界猪业第二大病毒病。国内多个省份对PCV-2区域流行病学方面先后进行了系统分析，福建省的福州、泉州都有相关报道。

疫苗免疫仍然是防控PCV-2的最好方法。目前市场上的PCV-2疫苗主要有全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗2种。使用亚单位疫苗免疫，可以通过采用另外一种蛋白来检测是否存在野毒感染，具有独特的优势。因此，本研究选择PCV-2亚单位疫苗免疫的猪作为研究对象，并采用ORF3蛋白作为间接ELISA的包被抗原对所收集的样品进行检测，获得PCV-2野毒感染的相关数据。

对漳州市部分猪场已免疫PCV-2亚单位疫苗的猪进行血清学调查，发现经PCV-2亚单位疫苗免疫后，抗体阳性率较高，但是同时也发现部分猪只仍然存在带毒或曾被野毒感染现象，这种感染是在疫苗免疫前感染还是疫苗免疫后感染的，有待进一步研究。本研究为今后有效防控PCV-2具有一定的参考意义。