滋阴潜阳养血安神法对室性心律失常大鼠心电图及Nav1.5电流的影响

2020-02-16邹飞虎付玲梁波周燕廖慧玲

医学信息 2020年1期

邹飞虎付玲梁波周燕廖慧玲

摘要：目的探討滋阴潜阳养血安神法对室性心律失常大鼠心电图及对Nav1.5电流的影响。方法将健康雄性SD大鼠30只随机分为模型组、对照组，滋阴潜阳养血安神组，每组10只。模型组给予生理盐水灌胃，对照组给予美托洛尔灌胃，滋阴潜阳养血安神组给予定悸复脉汤灌胃，灌胃2周后，通过生物机能实验系统BL-420F记录心电图的变化，以100 μmol/L利多卡因为阳性对照，采用全细胞膜片钳技术测定不同浓度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）定悸复脉汤浓缩液对CHO细胞Nav1.5电流的影响，绘制量效曲线图并拟合IC50曲线。结果模型组室性心律失常发生率为100.00%，滋阴潜阳养血安神组室性心律失常发生率为90.00%，对照组室性心律失常发生率为80.00%。滋阴潜阳养血安神组和对照组心律失常出现时间长于模型组，心律失常持续时间短于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。滋阴潜阳养血安神组和对照组心律失常出现时间、心律失常持续时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。采用贴壁培养方式，镜下可见CHO细胞成纤维细胞样，胞体较小，呈长梭形，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞轮廓清楚，具有突起。100 μmol/L的利多卡因对CHO细胞Nav1.5电流的抑制率为（39.14±3.96）%。不同浓度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸复脉汤浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流均有不同程度的抑制作用，抑制率分别为（48.79±0.65）%、（36.24±0.92）%、（26.95±1.80）%和（21.52±1.65）%，IC50=（24.0±2.4）g/L。结论滋阴潜阳养血安神法可推迟室性心律失常出现时间，缩短室性心律失常持续时间，其作用可能与抑制Nav1.5电流有关。

关键词：滋阴潜阳养血安神法;室性心律失常;大鼠;心电图;Nav1.5电流

中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.023

文章编号：1006-1959（2020）01-0072-05

Effect of Ziyin Qianyang Yangxue Anshen Method on Electrocardiogram and Nav1.5 Current

of Ventricular Arrhythmia

ZOU Fei-hu1，FU Ling2，LIANG Bo3，ZHOU Yan3，LIAO Hui-ling3

（1.Department of Cardiology，Tongliang District Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 402560，China;

2.Department of Respiratory Medicine，Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400020，China;

3.Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To investigate the effects of n Ziyin Qianyang Yangxue Anshen methodon electrocardiogram and Nav1.5 current in ventricular arrhythmia rats. Methods 30 healthy male SD rats were randomly divided into a model group， a control group and a Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group， with 10 rats in each group. The model group was administered with saline， the control group was administered with metoprolol， the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group was administered with Dingji Fumai Decoction， and 2 weeks later， it was recorded by the BL-420F Electrocardiogram changes， 100 μmol/L lidocaine as a positive control， using whole-cell patch-clamp technology to determine different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） of Dingji Fumai Decoction for CHO cells Nav1.5 current effect， draw a dose-response curve and fit the IC50 curve.Results The rate of ventricular arrhythmias in the model group was 100.00%， the rate of ventricular arrhythmias in the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group was 90.00%， and the rate of ventricular arrhythmic rats in the control group It is 80.00%. The arrhythmia occurred longer in the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group and the control group than in the model group， and the arrhythmia duration was shorter than that in the model group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the occurrence time and duration of arrhythmia between the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group and the control group （P>0.05）. Adherent culture was used to show that CHO cells were fibroblast-like， with small cell bodies and long spindle-shaped cells. They were spindle-shaped or star-shaped flat cells with multiple protrusions， with clear cell outlines and protrusions. The inhibition rate of 100 μmol / L lidocaine on Nav1.5 current in CHO cells was （39.14±3.96）%. Different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） of Dingji Fumai Decoction can inhibit Nav1.5 current in CHO cells to varying degrees. The inhibitory rates of Dingji Fumai Decoction concentrated liquid of different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） on Nav1.5 current in CHO cells were （48.79±0.65）%，（36.24± 0.92）%，（26.95±1.80）% and （21.52±1.65）%， IC50=（24.0 ± 2.4） g/L.Conclusion The method of Ziyin Qianyang Yangxue Anshencan delay the occurrence time of ventricular arrhythmia and shorten the duration of ventricular arrhythmia. Its effect may be related to the suppression of Nav1.5 current.

Key words：Ziyin Qianyang Yangxue Anshen method;Ventricular arrhythmia;Rats;Electrocardiogram; Nav1.5 current

室性心律失常（ventricular arrhythmias）包括室性早搏、室性心动过速、心室颤动等，严重时可引起心源性猝死，危及生命。中药能够多途径、多环节、多靶点阻断心律失常的發生，在治疗各种室性心律失常的临床应用中效果显著。罗玲主任中医师在临床实践中发现，以滋阴潜阳养血安神法指导下形成的定悸复脉汤在抗室性心律失常方面安全有效，且临床观察及动物试验已证实该方的有效性[1，2]，为研究其作用机制，本研究探讨滋阴潜阳养血安神法对室性心律失常大鼠心电图及对Nav1.5电流的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠30只，体重（200±20）g，由西南医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（川）2013-17。稳定表达人Nav1.5的中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO），购自HW BioPharma公司。

1.2主要实验试剂定悸复脉汤免煎颗粒由酸枣仁、茯神、川芎、龙骨、牡蛎、桂枝、远志、大枣、合欢皮、炙甘草十味中药组成（由四川新绿色药业科技发展有限公司提供）;定悸复脉汤组成中药材，由西南医科大学附属中医医院提供;酒石酸美托洛尔片，由阿斯利康制药有限公司提供（批号：201701A06，规格： 25 mg×20片）;氯化钡，由Alfa Aesar公司提供（批号：T22C006，规格：5 g/支），1% 戊巴比妥钠。

1.3主要实验仪器 BL-420F生物信号采集处理系统（成都泰盟科技有限公司生产）。

1.4方法

1.4.1实验分组及给药将30只健康SD雄性大鼠随机分为模型组、对照组，滋阴潜阳养血安神组，每组10只。模型组给予生理盐水灌胃，对照组给予美托洛尔灌胃，滋阴潜阳养血安神组给予定悸复脉汤灌胃，均按2 ml/kg进行，1次/d，连续2周。

1.4.2动物模型制备于2周后称重，并灌胃给药， 30 min后，予以1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定于木板上。在大鼠四肢内侧皮下插入针灸针，连接电极，使用BL-420F生物机能实验系统记录心电图。通过尾静脉快速推注0.4%氯化钡4 mg/kg溶液，5 s内推注完毕，记录心电图。另通过BL-420F生物机能实验系统记录心电图20 min，分别记录室性心律失常出现时间及持续时间。

1.4.3定悸复脉汤浓缩药液制备由两名副主任药师及以上职称药师鉴定为正品。将组成中药材加入8倍体积量蒸馏水，室温（20～25℃）下浸泡1 h，煎煮30 min，滤过;滤渣中加入6倍体积量蒸馏水，煎煮30 min，滤过;合并前后2次煎煮后所得滤液，将滤液减压浓缩后经0.22 μm过滤器过滤后作为浓缩药液，分装灭菌后于-80℃冻存备用。实验时将浓缩药液进行相应倍数稀释后获得实验终浓度。

1.4.4溶液配制 ①细胞内液（mmol/L）：KCl 40、KF 100、MgCl2、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA）5、HEPES 10。②细胞外液（mmol/L）：NaCl 137、MgCl2 1、KCl 4、Glucose 10、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES] 10、CaCl2 1.8。③胰蛋白酶液：将胰蛋白酶0.25 g和乙二胺四乙酸二钠（edetate disodium，EDTA-2Na）0.02 g用1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）充分溶解，定容至100 ml，并用0.2 μm的滤器过滤。④阳性对照化合物：选用利多卡因作为实验阳性对照化合物，将化合物溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中配置成100 mmol/L的储存液，实验时用细胞外液梯度稀释后获得所需终浓度。

1.4.5 CHO细胞的培养及传代稳定表达人Nav1.5的CHO细胞常规培养，传代在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和400 μg/ml遗传霉素（G418）的F-12培养基中。于35 mm培养皿每2～3 d传代1次。在37℃、5% CO2培养箱中放置24 h后用于实验。

1.4.6全细胞膜片钳记录将细胞置于培养皿中静置10 min，贴壁后换用细胞外液进行清洗以除去残悬浮的细胞碎片。使用PC-10水平拉制仪拉制玻璃微电极，电极入液电阻保持在3～5 MΩ，选用表面光洁、清晰、饱满、折光性较好、贴壁良好的细胞进行实验，串联阻抗（65%左右），采用全细胞膜片钳技术（吸破式），电压刺激方案为先将细胞钳制在-130 mV，然后去极化至-10 mV，持续15 ms，最后恢复至-130 mV;然后选择电流20%～30%失活时的钳制电压进行记录，电流在细胞外液中至少稳定记录2 min。给药（浓缩药液、阳性对照化合物）均以2 ml/min恒速灌流给药，灌流给药后药物作用达到稳态的判断标准为电流幅值变化在5%以内。在整个实验过程中，初始电流要求为1～10 nA，膜电阻应达到或超过1 GΩ，全细胞记录模式建立后串联电阻应在5 MΩ以内，漏电流控制在离子通道电流的10%以内。

1.5统计学方法使用Clampex 10.5软件（Axon， USA）记录Nav1.5电流，结合pCLAMP 10.5软件（Molecular Devices，USA）和GraphPad Prism7软件及SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行比较，以α=0.05作为检验水准，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1三组室性心律失常发生率比较模型组室性心律失常发生率为100.00%（10/10），滋阴潜阳养血安神组室性心律失常发生率为90.00%（9/10），对照组室性心律失常发生率为80.00%（8/10）。

2.2三组室性心律失常心电图指标比较滋阴潜阳养血安神组和对照组心律失常出现时间长于模型组，心律失常持续时间短于模型组，差异有统計学意义（P<0.05）。滋阴潜阳养血安神组和对照组心律失常出现时间、心律失常持续时间比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 CHO细胞培养采用贴壁培养方式，CHO生长较快，镜下可见CHO细胞成纤维细胞样，胞体较小，呈长梭形，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞轮廓清楚，具有突起，见图1。

2.4阳性对照化合物利多卡因对CHO细胞Nav1.5电流的作用 100 μmol/L的利多卡因对CHO细胞Nav1.5电流的抑制率为（39.14±3.96）%，具有明显的抑制作用，见图2。

2.5不同浓度定悸复脉汤浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流的作用不同浓度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸复脉汤浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流均有不同程度的抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显，见图3。

2.6不同浓度浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流的抑制率及量效不同浓度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸复脉汤浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流的抑制率分别为（48.79±0.65）%、（36.24±0.92）%、（26.95±1.80）%和（21.52±1.65）%，见图4A、图4B。根据不同浓缩药液浓度绘制量效曲线图，并通过GraphPad Prism7软件拟合浓缩药液对CHO细胞Nav1.5电流的IC50，得IC50=（24.0±2.4）g/L，见图4C、4D。

3讨论

心律失常是激动产生部位和（或）传导发生异常，以不规则的心搏频率和心跳节律为特点的心血管系统常见疾病。临床上约50%的心脏猝死与心律失常相关[3]。室性心律失常所致的心源性猝死每年可导致全球4～5百万人死亡[4，5]。当心脏发生心律失常时，其离子通道和离子转运体发生明显的变化[6]，而离子通道的改变可影响离子流，从而影响心室肌细胞的动作电位时程。

心肌细胞的动作电位和其他兴奋细胞一样，来源于肌细胞的动作电位电导变化形成的跨膜离子流，即膜电流。而膜两侧的电位差和离子浓度差决定离子流的方向和速度，心肌的电生理学特性是由心肌细胞膜的离子如Ca2+、K+和Na+等跨膜移动所决定的[7]。心室肌AP由以下时期组成：0期（快速去极期）、1期（快速复极期）、2期（平台期）、3期（复极期）和4期（静息期），其中钠电流INa参与了0、2、4期。心室肌细胞0期的去极化以INa为主。INa是一种快速内向离子流，80 mV被快速激活（0.5 ms内），大量Na+内流，膜电位迅速去极化，越过0电位形成超射。2、4期与慢失活的INa有关，在其受到激动或INa的失活受阻时，它可以明显加强，使AP难以复极，动作电位时程APD延长。

钠通道是选择性允许Na+跨膜通过的离子通道，主要是电压门控离子通道，其功能是维持细胞兴奋性及其传导。在心脏，动作电位始于快钠通道的激活，Na+内流引起动作电位的0期去极化。INa异常会导致一系列的心律失常[8]。钠通道蛋白1.5亚型（Nav1.5）由SCN5A基因编码，是心脏组织中存在的主要钠通道的α亚基，形成了钠电流流动的主要通道，其在心肌细胞的润盘、侧膜和T管均有表达[9]。Nav1.5通道可与润盘外Ankyrin-G及缝隙连接蛋白、桥粉蛋白、Caveolin-3等多种蛋白结合，如结合异常，或蛋白表达异常，或发生基因突变，可导致Nav1.5向细胞膜的转运异常，或钠通道下调，从而导致钠电流降低，影响心脏的兴奋性，增加传导障碍和心律失常的易感性，导致心律失常发生。

心律失常临床主要表现为心慌、胸闷等，属祖国医学“心悸”范畴，中医药治疗室性心律失常目前已成为研究热点。中药汤剂针对病因病机治疗，疗效确切，能够减轻患者的临床症状，且毒副反应较轻。历代医家认为，心悸的发生与体虚劳倦、情志、外邪、饮食等因素有关，病理性质可分为虚与实，虚者不外乎为气血阴阳亏虚;实证为痰、火、气、瘀扰动心，因而目前较常见的治法主要为益气活血、辛温通阳、清热化痰安神、疏肝解郁等[10-13]，且发现部分中药或中药复方抗心律失常与其作用于离子通道有关[14，15]。罗玲主任认为，心主血脉、心主神志，阴血亏虚、阴不潜阳、血不养心，则心神不宁，正如《丹溪心法》曰：“人之所主者心，心之所养者血，心血一虚，神气不守，此惊悸之所肇端也。”《古今医统大全·惊悸门》曰：“治惊悸必先以养心安神之剂，随后豁痰。”认为治疗心律失常应以滋阴潜阳养血安神为主，拟方定悸复脉汤，并在临床观察中发现有较好的疗效。

定悸复脉汤由酸枣仁、茯神、川芎、龙骨、牡蛎、桂枝、远志、大枣、合欢皮、炙甘草十味中药组成，实由酸枣仁汤合龙骨牡蛎汤加减而成。而酸枣仁汤养血安神，龙骨、牡蛎潜阴潜阳，共为君药;大枣养血，为臣药;合欢皮安神解郁，为佐药;炙甘草治“心动悸、脉结代”，为佐使药;诸药合用，具有滋阴潜阳，养血安神之功。实验研究已证实，酸枣仁具有镇静，抗心律失常，川芎具有捕获自由基及Ca2+拮抗作用[16]，灸甘草亦可改善心律失常心电图[17]。本研究结果表明，以滋阴潜阳，养血安神法为主的定悸复脉汤可推迟氯化钡模型大鼠室性心律失常出现时间，缩短其室性心律失常持续时间。同时通过采用全细胞膜片钳技术观察定悸复脉汤对CHO细胞Nav1.5电流的影响，结果发现定悸复脉汤浓缩液对Nav1.5电流有抑制作用，且随着浓度的增加，对Nav1.5电流抑制率越大，抑制作用越明显，CHO细胞Nav1.5电流的时程越长，再次证明定悸复脉汤可抑制Nav1.5电流，延长心肌细胞动作电位的时程，使心率变慢，滋阴潜阳养血安神法抗室性心律失常确切有效。

综上所述，滋阴潜阳养血安神法可推迟室性心律失常出现时间，缩短室性心律失常持续时间，其作用可能与抑制Nav1.5电流有关。

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