转录因子Sox2对视网膜发育和功能的影响及作用

沈雨濛，沈吟

(武汉大学人民医院眼科中心，武汉 430060)

转录因子Sox2(sex determining region Y-box 2)由定位于第3号常染色体长臂26区3带至27区(q26.3～q27)的Sox2基因编码表达[1]，在哺乳动物体内广泛存在，功能涉及眼发育、性别决定、神经系统发育等方面[2]。Sox2在胚胎发育和细胞分化的多个时期均有表达，对未分化的胚胎干细胞、神经干细胞等的再生能力及干细胞的多能性至关重要，可在胚胎发育最早期开始起作用[3-4]。除具有维持细胞发育及细胞干性功能外，Sox2还兼具影响新陈代谢、增殖、凋亡与化学抵抗、侵蚀、肿瘤的成瘤和细胞的迁移等作用。

有研究表明，Sox2缺乏会引起成年小鼠神经退行性病变和神经损伤[5]。人眼中由Sox2基因缺陷引起的眼部病变具有非常典型的特征，统称为Sox2无眼球综合征，其临床表现除先天性小眼和无眼畸形外，还伴有先天性食管闭锁、生殖系统异常、脑部发育异常、垂体发育不全等[6-7]。先天性小眼症和无眼症是一种少见的眼球发育缺陷，有资料显示，先天性小眼症的患病率约为3/10万，先天性无眼症为14/10万[8]。Sox2是目前唯一明确的引起先天性小眼症和无眼症的单基因突变致病基因[8]。目前，对Sox2 无眼球综合征的研究尚处于临床病例收集和汇总阶段，对其致病机制的研究非常有限[9-10]。全面认识Sox2对视网膜发育和功能的影响，有助于眼科医师研究与其相关眼病的病理机制，为相关疾病的防治提供新思路。

1 Sox2基因敲除小鼠的视网膜表现

在中枢神经系统的发育过程中，神经元和神经胶质细胞均由一组放射状的神经前体细胞(neural progenitor cells，NPCs)发育形成。Sox2是高迁移率族蛋白转录激活因子(属于SoxB1亚家族)的一员，在发育中和成熟后的中枢神经系统的前体祖细胞干性的维持中发挥重要作用[11]。若Sox2功能在胚胎和中枢神经系统中受到损伤和破坏，将导致NPCs和成熟神经元数量的减少[12]。目前，关于Sox2维持NPCs干性的机制尚未阐明。

在脊椎动物中，视网膜中的六种神经元细胞和一种神经胶质细胞均由视网膜前体细胞(retinal progenitor cells，RPCs)按照特定的时间顺序发育形成[13]。为了确保视网膜中各种细胞发育成熟且细胞间比例正确，在整个视网膜发育过程中均需保证RPCs干性的维持与分化之间的平衡，这种平衡通过调节神经元细胞发育的各种转录因子的共同协调实现，如具有碱性螺旋-环-螺旋结构和同源盒家族的转录因子[14]。

转录因子Sox2在视网膜发育的各阶段均有表达。在新生小鼠视网膜中，Sox2在RPCs中大量表达，随着视网膜发育成熟，在出生4～10 d小鼠视网膜中可见，随着视网膜明显分层的逐渐出现，转录因子Sox2的表达也逐渐定位于神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)和内核层(inner nuclear layer，INL)。在成年小鼠视网膜中，转录因子Sox2在GCL和INL稳定表达，包括Müller细胞、无长突细胞以及Glial胶质细胞[15]。

有研究表明，敲除Sox2转基因成年小鼠出现视神经变细、视交叉结构紊乱等发育不良现象，并且神经节细胞、水平细胞、无长突细胞、视杆双极细胞、视杆光感受器细胞等各种类型细胞的数量显著减少；仅敲除一条染色体的Sox2基因时，上述现象较敲除两条染色体Sox2基因时减轻，说明转录因子Sox2对视网膜发育的影响与其表达量呈正相关；此外，该研究还发现，转录因子Sox2通过直接调控Notch1转录因子的表达影响视网膜的发育[16]。在Sox2突变小鼠中，Sox2的表达精确调节了RPCs的分化时间及其迁移位置[17]。在Sox2基因敲除小鼠中，NPCs异常分化且缺乏Sox2对Notch信号通路的激活，从而引起RPCs增殖减少，导致小眼症[16]。另有研究表明，Sox2缺乏会引起成年小鼠神经退行性病变和神经损伤[5]。

2 转录因子对RPCs的影响

RPCs在分化发育为各神经元细胞的过程中需保持多能干性。维持RPCs中Sox2和人配对盒基因6(paired box gene 6，Pax6)含量的比例对维持RPCs的多能干性至关重要[18]。在人类和小鼠的眼中，转录因子Pax6突变或过表达导致眼部表型异常，出现小眼症、无眼症、白内障和无虹膜眼[19-23]。条件性敲除小鼠RPCs的Pax6将导致除γ-氨基丁酸能无长突细胞外的所有类型视网膜细胞数量的减少；同时，Pax6在虹膜和睫状体上皮中也高度表达，对于RPCs的发育和分化起重要作用[24-25]。视网膜Sox2水平自视网膜中央向边缘逐渐降低，而视网膜中Pax6水平与Sox2的分布相反，自视网膜中央向边缘逐渐升高[26]。有研究表明，抑制RPCs中Sox2活性时，RPCs中与神经元发育相关转录因子(如Notch1)的表达急剧减少，导致RPCs神经干性丧失，同时Pax6以及睫状上皮(非神经元)标志物的表达水平升高，使本该发育为神经元的细胞向睫状体非神经元上皮发育和分化[16,26]。因此，转录因子Sox2的正确表达是维持RPCs神经干性不可或缺的因素，其缺失或表达减少均将引起RPCs异常分化，导致视网膜发育异常。

3 转录因子Sox2对视网膜Müller细胞发育的影响

3.1Müller细胞的发育过程 在脊椎动物出生后，视网膜中的RPCs主要分化为视杆光感受器细胞、双极细胞和Müller细胞[14]，其中Müller细胞是唯一同时保持RPCs形态和类似基因的视网膜神经细胞[8,22,27]。Müller细胞是脊椎动物视网膜中的神经胶质细胞，其上端达外界膜，下端达内界膜，贯穿视网膜全层。Müller细胞作为视网膜的支持细胞，对视网膜的神经保护、营养、代谢等起重要作用；同时，Müller细胞作为脊椎动物视网膜的基础胶质细胞，是一种生理状态下的静止前体细胞，在生理稳态条件下，Müller细胞具有维持视网膜正常结构和提供神经元营养支持的功能。Müller细胞表达大量的前体细胞相关的转录因子，但仍保存前体细胞的形态，在视网膜出现损伤时被激活，可在一定程度上修复视网膜的结构和功能。研究表明，Müller细胞的NPCs功能具有可逆性，当视网膜受到损伤后，它们可以重新进入细胞周期，并具有分化产生神经元的潜力[28]。因此，Müller细胞被认为是视网膜中潜在的NPCs，也是国内外视网膜损伤治疗关注的关键靶点之一。当视网膜受到损伤后，Müller细胞将重新进入细胞分裂周期[29]，这一过程涉及多种调控胚胎发育的信号通路，其中Notch信号通路非常关键，不仅调控了NPCs的功能，还调控了胶质细胞的再生[30]。发状分裂相关增强子1/5是Notch通路下游的调控因子，不仅是出生后视网膜发育过程中Müller细胞的重要标志物，还在确定Müller细胞身份方面发挥至关重要的作用[31]。发状分裂相关增强子1通过其持续的非振荡表达调节神经干细胞的静止状态，并可以防止细胞在静止状态下进入不可逆转的分化周期[32]。在中枢神经系统发育的过程中，Notch1是Sox2的直接转录目标[26]。在Sox2蛋白敲除新生小鼠视网膜中，Notch1和发状分裂相关增强子5的表达减少，从而影响Müller细胞重新进入细胞分裂周期。

3.2Sox2对Müller细胞发育的具体影响 在新生小鼠视网膜中，Müller细胞需要转录因子Sox2来阻止其最终的有丝分裂。在小鼠视网膜Müller细胞中，条件性敲除转录因子Sox2的表达，将引起新生Müller细胞失去正常形态而呈放射状或异常的细胞分裂状态，其胞体原定位于网状层，但敲除转录因子Sox2后，其胞体异常定位于核细胞层，并可能引起整个视网膜失去正常的结构形态[15]。视网膜电图结果显示，条件性敲除小鼠视网膜Müller细胞中的转录因子Sox2，视网膜电图b波的幅度较正常小鼠下降，说明敲除转录因子Sox2后的视网膜整体功能受到了影响[33]。Gorsuch等[34]的研究表明，当正常斑马鱼光损伤31 h后，其视网膜Müller细胞大量增殖；利用吗啉代使斑马鱼视网膜Müller细胞中Sox2表达减少后，Müller细胞的增殖大大减少，而重新在Müller细胞中过表达Sox2后，Müller细胞的增殖又增多，可见转录因子Sox2是视网膜Müller细胞增殖和发育过程中必不可少的重要转录因子。

4 转录因子Sox2对视网膜无长突细胞发育的影响

4.1无长突细胞的分类和发育过程 无长突细胞是视网膜中的中间神经元，其树突分叉延伸至内丛状层，与神经节细胞和(或)双极细胞连接形成突触，负责输出双极细胞的信息，特异性很高。根据树突形态和层级分类可至少将无长突细胞分为33种不同的亚型，各型无长突细胞通过释放一种或多种神经递质与其他视网膜神经细胞相联系。根据无长突细胞释放的神经递质的种类可以分为γ-氨基丁酸能、甘氨酸能或其他类型无长突细胞。γ-氨基丁酸能无长突细胞通常细胞胞体较大，主要分布在视网膜GCL和INL，目前对星形无长突细胞(一种γ-氨基丁酸能无长突细胞)的研究较多，星形无长突细胞以释放胆碱乙酰转移酶为特征，被认为参与调控了视觉的方向选择和方向性活动，故称为胆碱能无长突细胞；星形无长突细胞呈显著的星形放射形态，在视网膜GCL和INL成簇分布[35]，且单个星形无长突细胞的树突很少相互交叉，形成特征性“星爆”形态[36]，故又称星爆无长突细胞(starburst amacrine cell，SBACs)，但相邻细胞间的树突状高度重叠[37]，并形成相互抑制性突触[38]。胆碱能无长突细胞是最易辨认的视网膜无长突细胞，也是视网膜中唯一的胆碱能神经元[39]。根据胆碱能无长突细胞的胞体分布及其树突位置(INL的ON层和OFF层)分为ON型(GCL)和OFF型(INL)[40]，虽然胆碱能无长突细胞的数量仅占无长突细胞总数的5%，占整个视网膜神经元细胞总数的0.5%，但具有显著的细胞形态和分布特征，是目前研究最多、最深入的无长突细胞[41-42]。

4.2Sox2对无长突细胞发育的影响 哺乳动物胚胎形成后10 d至出生后4 d，无长突细胞由视网膜神经生发层分化[43]，无长突细胞发育早期，胆碱能无长突细胞在视网膜内层呈单层分布[44]，随后逐渐分化为ON型和OFF型两种不同胆碱能无长突细胞[45]。在胆碱能无长突细胞迁移至视网膜内部定位于INL和GCL并分为两个单独的细胞层之前，条件性敲除胆碱能无长突细胞中的Sox2基因，将导致INL和GCL中胆碱能无长突细胞数量的变化，导致INL中的胆碱能无长突细胞数目增多，而GCL中的胆碱能无长突细胞数目减少，但两层胆碱能无长突细胞的总数未发生变化；此外，胆碱能无长突细胞的细胞表型也发生了变化，条件性敲除无长突细胞中Sox2基因后，GCL中的大部分胆碱能无长突细胞的树突呈双向分布，而位于INL的胆碱能无长突细胞失去了正常胆碱能无长突细胞应有的嘌呤受体2表达[46]。在条件性敲除Sox2的视网膜中，胆碱能无长突细胞的整个树突分布区域面积并无变化[47]，且细胞未出现更多的树突间交叉[48]。Sox2通过诱导Pax6、神经源性分化蛋白D启动子诱导RPCs分化为无长突细胞[49]。

5 转录因子Sox2对视网膜双极细胞发育的影响

5.1视网膜双极细胞的发育过程 在小鼠视网膜发育过程中，双极细胞的发育和分化主要发生在出生后，在出生后第3天达到高峰[50]。双极细胞是视网膜的第二级神经元，与其上级的光感受器细胞和下级的神经节细胞相连接，将从光感受器细胞接收的信号传递给神经节细胞，且双极细胞还通过旁突触缝隙连接与无长突细胞和水平细胞相连接[51]。根据功能可将双极细胞可分为视锥双极细胞和视杆双极细胞，双极细胞的突触输入来自杆或锥光感受器细胞，由此可将双极细胞分为视杆双极细胞或视锥双极细胞[52]，视锥双极细胞有10种类型，而视杆双极细胞只有1种类型；根据轴突位置又可将双极细胞分为OFF型和ON型，其中近3/4的双极细胞为ON型[53]。在小鼠视网膜中，ON型双极细胞包括视锥和视杆两种双极细胞类型，OFF型双极细胞仅包含视锥双极细胞[54]。

5.2Sox2对双极细胞发育的影响 ON型和OFF型双极细胞通常分别与ON型和OFF型的 SBACs建立突触连接。双极细胞表面表达不同的钙黏素，是双极细胞与其他细胞进行突触连接的特异识别位点[55]。有研究发现，在条件性敲除Sox2的小鼠视网膜中，位于GCL的ON型SBACs可接收来自ON型和OFF型双极细胞的兴奋性信号；与正常小鼠相比，Sox2敲除小鼠ON型和OFF型SBACs动作电位的振幅减少，反应时间缩短，说明Sox2敲除小鼠视网膜中SBACs与双极细胞间的突触连接异常[56]。

6 小 结

Sox2是哺乳动物胚胎发育过程中必需的转录因子，具有维持细胞多能性和干性的功能，可促使已分化的细胞重新进入分裂周期[57]；此外，Sox2对器官发育至关重要，如眼的正常发育，Sox2基因突变会导致小眼症、无眼症和其他眼部营养不良[58]，并影响视网膜及视网膜中各类细胞(如Müller细胞、无长突细胞及双极细胞)的发育。Sox2是目前唯一明确的单基因突变引起先天性小眼球和无眼球的致病基因。如何有效治疗眼遗传性疾病一直是眼科医师的努力目标，目前治疗眼遗传性疾病的主要方法有干细胞疗法、基因治疗、人工视网膜等，利用Sox2转录因子对眼部发育的促进作用及其维持RPCs干性的特性，可在基因水平利用基因编辑技术治疗视网膜遗传性疾病。充分了解Sox2对视网膜发育和功能的影响及机制，将为视网膜遗传病、视网膜发育不良等疾病的研究和治疗提供新方向。