苹果酸乳酸发酵对葡萄酒中活性成分的影响

袁 林,赵红玉,刘龙祥,田萌勃,彭 帅,李 华,3,4,*,王 华,3,4,*

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌 712100;2.山东省黄河三角洲脆弱生态带工程技术研究中心,山东滨州 256600;3.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心,陕西杨凌 712100;4.西北农林科技大学合阳葡萄示范站,陕西渭南 715300)

苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF),又称“二次发酵”(secondary fermentation),是提高葡萄酒感官复杂性的关键生产过程。是在乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB),大部分是酒酒球菌的作用下,通过苹果酸-乳酸酶将酒体中酸涩感较强的L-苹果酸脱羧基降解为较柔和的L-乳酸,同时释放出CO2[1]。MLF对葡萄酒的品质有着很重要的影响,它能降低葡萄酒的酸度、提高微生物稳定性,并且能改变葡萄酒的口感、色泽、香气等[2]。这一发酵过程不仅在红葡萄酒中起重要作用,同时在一些白葡萄酒、起泡葡萄酒和烈酒中也是必不可少的[3-5]。

近些年来,随着国人越来越青睐酸度较高且口感清爽的酒体,红葡萄酒的MLF从必不可少的酿造工艺变得可有可无,甚至已被一些葡萄酒厂摒弃。然而,一些中国野生葡萄种质资源,如山葡萄、毛葡萄、刺葡萄等,其营养物质丰富、耐受性良好、丰产性强[6-8],很适宜作为酿酒葡萄大力推广,酿造具有中国特色的本土葡萄酒,但酸度高和糖度低是中国野生葡萄种质资源作为酿酒原料的两大挑战[9]。糖度低的问题目前基本已可以通过选择良好的生态种植环境、控制产量[10]、适时喷施叶面肥[11]、优化发酵条件[12]等措施解决。因此降低总酸度是酿造优质中国野生葡萄酒所面临的关键问题,而MLF这一生物降酸方法正是解决这一问题的有效途径之一[13]。除有效降酸外,经MLF后的葡萄酒中的一些活性成分对人体健康还有着正面的影响。本文对经MLF的葡萄酒中的活性成分及其功效进行综述,以期为研究利用中国野生葡萄种质资源、酿造优质中国野生葡萄酒提供参考。

1 MLF后葡萄酒中活性成分

1.1 氨基酸

葡萄酒中的肽类组成非常复杂,不仅能改变葡萄酒的口感和香气,还可作为氮源为酵母菌和乳酸菌提供丰富的营养[14],氨基酸的组成和含量对于葡萄酒香气的复杂性也起着重要作用[15]。Zhang等[16]使用GC-MS法检测了赤霞珠葡萄酒MLF过程中11种氨基酸的变化情况,发现其呈波动变化:在初始阶段,除一种氨基酸(γ-氨基丁酸)外,所有检测到的氨基酸均减少,之后氨基酸含量全部增加,最后除天冬氨酸外都再次减少,但各氨基酸在经过MLF后的最终含量均较MLF前有所增加或不变。而高年发等[17]用HPLC法测量多个中国葡萄酒产区的葡萄酒在酿造过程中氨基酸含量的变化,发现大多数在MLF阶段含量增加的氨基酸的增长主要是在MLF的前期,而在后期增长缓慢或不增长。出现这种变化趋势不同的原因可能是由于触发MLF的乳酸菌不同。Jin等[18]分析了4种不同的酒酒球菌接种条件下MLF前后的氨基酸变化,发现有3种会导致氨基酸总量下降,1种导致氨基酸总量上升。因此,MLF期间葡萄酒中总氨基酸的变化很大程度上取决于不同的品种和LAB菌株。葡萄酒MLF过程中氨基酸的减少是由于为乳酸菌提供氮或是在二羰基化合物存在下被氧化成醛[19],而增加则是由于酵母菌或葡萄酒中其他细菌自溶而导致蛋白或肽的水解[20]。MLF过程中氨基酸的变化对葡萄酒感官特性的影响主要取决于氨基酸氧化所产生的葡萄酒风味,如苯丙氨酸经氧化形成具有花香特征的苯乙醛[19];缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸分别经氧化形成2-甲基丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等[21-22]。因此这也是葡萄酒在MLF后口感和香气发生改变的重要原因。

1.2 益生菌

益生菌又称微生态调节剂、活菌制剂,指能够促进肠内菌群生态平衡,对宿主起有益作用的活的微生物制剂[23]。益生菌的保健作用包括缓解乳糖不耐症、维持肠道菌群的微生态平衡、降血脂、预防心脏疾病、抑菌作用及抗癌功效等[24]。目前,大量研究都表明补充益生菌的最佳食品是发酵乳制品[25],而在葡萄酒中鲜有研究。但随着世界范围内乳糖不耐受的人越来越多,以及发酵乳制品中的胆固醇对健康的不利影响,人们需要一种新的、非乳制品来源的益生菌。Garcia-Ruiz等[26]从葡萄酒中分离出了11种菌株,包括乳杆菌(Lactobacillus)、酒酒球菌(Oenococcus)和片球菌(Pedicoccus),并在模拟人类消化道的条件下评估了这11种菌株的益生菌特性(耐酸性、胆汁耐受性等),发现这些细菌的生存能力类似,甚至优于已知的几种对人类健康有益的细菌,这表明葡萄酒菌株对胃肠条件有良好的适应性;另外还发现葡萄酒中的细菌可以附着在肠壁上,这可以对人体产生有益的影响,例如排除病原体或肠道中的其它有害细菌,而这些细菌都源自于MLF过程。因此,经MLF的葡萄酒不仅可通过直接饮用使人体健康受益,而且其中所含的细菌还可作为潜在的益生菌从酒中提取出来,作为益生菌制剂销售,或是添加到功能食品中。

1.3 有机酸

有机酸是指一些具有酸性的有机化合物,葡萄酒中的有机酸具有抑菌、抗病毒、抗癌、促进钙、铁元素的吸收、帮助胃液消化脂肪和蛋白质等生理功能[27],同时由于其能调节pH,也对微生物生长和葡萄酒稳定起重要作用,还有一些有机酸如丙酮酸和α-酮戊二酸参与吡喃花色素的形成[28]。葡萄酒中的有机酸来自于葡萄(酒石酸,苹果酸和柠檬酸等),或来自于酒精发酵、乙醇氧化和MLF(乳酸,琥珀酸和草酸等)[29]。刘晶等[30]通过测定不同酿造工艺对葡萄酒中挥发性物质的影响,发现在无论是采用传统酿造方法,还是采用CO2浸渍法,进行MLF的葡萄酒中羧酸物质的总含量均比未经此发酵的葡萄酒中高,同时还出现了一些新的有机酸,如2-甲基己酸、棕榈酸、9-癸烯酸、丁酸和甲羟丙二酸,其中棕榈酸是弱极性化合物,呈显著脂肪酸和蜡香,略有果香和乳香,对于干红葡萄酒的味感平衡具有调节作用[31]。杨春霞等[32]采用离子色谱法分析了葡萄酒酿造过程中有机酸变化规律,发现在MLF过程中乳酸含量大幅增长,苹果酸含量大幅降低,琥珀酸含量稍有增加,这使葡萄酒减少了粗糙和尖厉,变得圆润柔和。因此,MLF增加了葡萄酒中有机酸的种类或含量,并改善了葡萄酒的风味。

1.4 多酚类物质

葡萄酒中含有大量的多酚类物质,这些多酚类物质不仅与葡萄酒的色泽、风味等品质指标密切相关,而且葡萄酒的各种保健功效也被认为由这些物质的抗氧化能力所贡献[33]。多酚类物质主要结构是苯环,其结构中有一个或多个羟基组。基于它们碳环结构的差异,酚类化合物可分为黄酮类和非黄酮类化合物。葡萄酒中的非黄酮类物质主要是酚酸和芪类。酚酸类属于小分子量物质,包括对羟基苯甲酸(没食子酸、香草酸、原儿茶酸及龙胆酸等)和对羟基肉桂酸(咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸及它们的衍生物);芪类主要为反式和顺式白藜芦醇。黄酮类物质的特征在于其C6-C3-C6骨架,主要包括花色苷、黄酮醇、黄烷醇和黄烷-3-醇(儿茶素和原花色素),以及少量的黄酮和类黄酮醇,它们之间的区别在于苯环上的羟基和甲氧基的数量及位置不同。这些基本结构以糖基化的形式或者以相应的糖苷形式或酯化形式存在[34]。

1.4.1 黄酮类化合物 许多科学研究已经揭示了红葡萄酒中黄酮类化合物的体外生物学性质。利用这些化合物的强抗氧化特性,黄酮类化合物可以潜在地预防与自由基相关的损伤,能够清除一定范围的活性氧(ROS)、氮化物(NO)和氯化物[35-37]以及抑制其他活性物质的产生[38],从而预防一些疾病,如保护心血管、预防癌症、肥胖、糖尿病和神经疾病等[39]。Garciaruiz等[40]检测MLF前后葡萄酒中的多种化合物的变化发现,槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等黄酮类物质的含量较MLF前显著上升,且这种变化可影响葡萄酒口感的收敛性。葡萄酒中黄酮类化合物的含量受温度、SO2等多种因素影响[41],MLF时较低的温度和SO2浓度可能促进了某些黄酮类化合物含量的升高,同时葡萄酒中的游离花色苷与其他多酚类物质相结合构成的辅色素也增加了葡萄酒黄酮类化合物的含量。因此,MLF可通过提高葡萄酒中黄酮类物质的含量,从而发挥对人体有益的作用。

1.4.2 酚酸 酚酸是葡萄及葡萄酒中最主要的非黄酮类化合物,作为一种次生代谢产物广泛存在于植物体中,这类化合物具有一个苯核。近年来研究发现,酚酸类物质对葡萄酒的风味、色泽等起着重要的作用,如咖啡酸具有抗氧化性,有助于葡萄酒颜色的稳定[42]。除此之外,酚酸具有营养保健作用和抗氧化性的药用价值,与人类的健康有密切关系[43-44]。李蕊蕊[45]测定了三个不同产区葡萄酒酿造过程中9种单体酚的变化规律,发现在进行MLF后,咖啡酸和香豆酸的含量均显著增加,鞣花酸和邻香草酸的含量也均有所增加。但这一结果会随着葡萄品种[46]、产地[47]、采收时间[48]等的改变而有所变化。Liszt等[49]的研究发现,葡萄酒中的儿茶素、咖啡酸等酚类物质可通过刺激胃酸分泌而有助消化,而且虽然MLF使红葡萄酒的味道更加圆润,但不会降低葡萄酒的刺激分泌潜力。因此,MLF可增加酚酸物质的含量,同时,可人为控制葡萄品种、采收时间等外在条件来提高葡萄酒中特定酚酸的含量,从而生产更益于人体健康的葡萄酒。

1.4.3 白藜芦醇 白藜芦醇(resveratrol,RES)是非黄酮类的多酚化合物,化学名3,5,4′-三羟基二苯乙烯,分子式C14H12O3,相对分子质量228.25,存在顺式和反式两种类型。1974年第一次从葡萄属植物中发现白藜芦醇[50],并首先定性为是一种能自身产生抗逆性的物质[51]。近些年来,国内外很多学者对白藜芦醇的生物学功能进行了深层研究,结果表明,白藜芦醇具有抗肿瘤[52]、抗心血管疾病[53-54]、抗氧化[55]、抗菌[56]、抗病毒[57]、抗炎[58]、保肝[59]及促进免疫调节[60]等一系列有益人类健康的生物药理活性。葡萄是白藜芦醇含量较丰富的食物之一[61],葡萄酒是人们获取白藜芦醇最直接、最广泛的方法。Pezet等[62]最早通过对佳美葡萄酒MLF之后白藜芦醇含量变化的研究发现:MLF后酒中白藜芦醇是酒精发酵结束时的2倍,并表明白藜芦醇可能以葡萄糖苷的形式或寡聚形式存在,游离白藜芦醇可以通过乳酸菌的酶活性释放出来。李婧等[63]通过测定赤霞珠葡萄酒酿造过程中白藜芦醇的变化,发现MLF后白藜芦醇总量同样较MLF前稍微有所提高。李志宇[64]通过对赤霞珠和马瑟兰葡萄酒中的白藜芦醇进行动态分析,发现在MLF后,两种葡萄酒中的反式白藜芦醇含量均下降,而顺式白藜芦醇含量均上升。反式白藜芦醇糖苷含量的降低,与乳酸菌有关,在MLF过程中,乳酸菌产生β-糖苷酶,脱除白藜芦醇中的糖基。而钱伟斌等[65]则发现,在MLF后,赤霞珠干红葡萄酒中的白藜芦醇含量发生部分损失(降低6.6%)。分析以上几个实验结果的差异可能是由于葡萄品种、MLF条件、检测方法不同而产生的,或可通过控制这些条件来提高MLF后葡萄酒中白藜芦醇的含量。

1.5 高级醇

高级醇(higher alcohols,HA),俗称杂醇油(fusel alcohol),是指具有三个碳以上的一元醇类,是葡萄酒发酵过程中不可避免的副产物,也是葡萄酒中的主要呈香物质。高级醇具有挥发性,适量的高级醇可增加葡萄酒的风味,如2-苯基乙醇具有玫瑰香气,丙醇、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇等具有麦芽的香气,但过量的高级醇会对人体造成危害[66]。当葡萄酒中的高级醇含量低于300 mg/L时,通常认为其有助于葡萄酒的香气复杂性,而浓度超过400 mg/L时,则会对葡萄酒质量产生负面影响。刘晶等[30]通过测定不同酿造工艺对葡萄酒中挥发性物质的影响,发现MLF可以增加酒样中醇类物质的含量,如异丁醇、异戊醇、正庚醇、L-(+)-2,3-丁二醇等,而并未丰富其种类,且经MLF后的葡萄酒中的高级醇总量均接近而未超过300 mg/L。而杨婷[67]在测定酒酒球菌OMEGA对蛇龙珠干红葡萄酒品质的影响分析中发现,经过MLF的葡萄酒样中的高级醇种类多于未经MLF的葡萄酒样(分别是22种、15种),多出的高级醇类包括2,3-丁二醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、1-壬醇等,总量同样也未超过300 mg/L。Knoll等[3]的研究证明,MLF前后葡萄酒中高级醇的含量变化会随着酒度、pH和接种的乳酸菌株不同而产生差异。但前两者的实验都可以在一定程度上说明,MLF可以有效丰富葡萄酒中高级醇,从而丰富葡萄酒的风味。

1.6 酯类

酯类物质是葡萄酒中重要的芳香物质之一,绝大多数酯类使葡萄酒形成愉快的香气[68]。卜潇等[69]通过测定接种4株不同植物乳杆菌启动的MLF前后葡萄酒香气成分的差异,发现经过MLF的酒样中酯类物质含量均显著高于未经过MLF的酒样,其中乙酯类物质含量有较大幅度的提升,主要包括乙酸乙酯和乳酸乙酯。Sulette等[70]使用红外光谱监测不同葡萄品种和不同酒酒球菌接种条件下MLF进程的研究中,发现一些酯类如乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯和丙酸乙酯的含量在不同葡萄品种和不同酒酒球菌的条件下均较MLF前有增长,而一些酯类如己酸乙酯、癸酸乙酯和丁酸乙酯的变化情况则随葡萄品种和酒酒球菌的改变而有所不同。分析两者结果可以说明无论是酒酒球菌还是植物乳杆菌触发的MLF,都可提高葡萄酒中酯类物质的含量。

2 活性成分的功效

2.1 抗癌作用

许多研究表明,葡萄酒中的黄酮类化合物、白藜芦醇等物质能阻止和抑制癌症的发生。Jang等[71]的研究表明,局部应用白藜芦醇使每只小鼠的皮肤肿瘤数量减少了98%,且白藜芦醇对肿瘤的起始、中期和发展3个阶段均有抑制作用。白藜芦醇可通过多种机制共同作用减缓肿瘤发展,一种是抑制两种环加氧酶的酶活性,一种是诱导细胞周期停滞和细胞凋亡[72]。目前,白藜芦醇已被证实对结肠癌[73]、乳腺癌[74]、前列腺癌[75]等多种肿瘤细胞产生不同程度的拮抗作用。其他多酚类物质也具有抗癌作用,如鞣花酸可诱导Caco-2结肠癌细胞凋亡[76],山奈酚可抑制血管内皮生长因子的释放而抑制乳腺癌和卵巢癌[77]。另外,葡萄酒中的多种乳杆菌类益生菌能够防治前列腺癌、乳腺癌、肝癌、盆腔癌、结直肠癌等,片球菌类益生菌也对结直肠癌有治疗作用[78]。

2.2 抗氧化作用

很早就有研究表明,经过MLF的红葡萄酒中的大多数多酚类物质都具有明显的抗氧化、抗自由基的作用,尤其是酚酸类物质,具有确切的营养和抗氧化等药理活性和药用价值,与人体健康密切相关。羟基肉桂酸衍生物阿魏酸和咖啡酸在诱导损伤小鼠的肝和脾细胞中显示了抑制脂质过氧化和清除活性氧的的抗氧化作用[79]。除了酚酸,白藜芦醇同样也具有显著的抗氧化、抗自由基作用,这可能与其化学预防作用有关。在体外,低剂量白藜芦醇后已显示出解毒酶的诱导作用[80],在体内,白藜芦醇已被证明可提高血浆抗氧化能力并降低脂质过氧化[81]。由于白藜芦醇的抗氧化作用,或许可通过调节乙酰胆碱酯酶来改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)小鼠的认知能力[82]。某些高级醇,如羟基酪醇[2-(3,4-二羟基苯基)乙醇],也被证明具有体外抗氧化活性,能够清除过氧化物、羟基、活性氮和超氧阴离子,破坏过氧化链反应和防止金属离子催化ROS的产生[83]。

2.3 抗心血管疾病

近年来,葡萄酒中活性成分对心血管系统的保护作用越来越引起学者们的注意。Camargo等[84]对22071人进行调查,发现每天饮2杯葡萄酒的人发生心绞痛和心肌梗死的危险几率分别降低到56%和47%。白藜芦醇可通过多种方式保护心血管系统,其在低浓度下可抑制凋亡细胞死亡,从而提供各种疾病的保护,包括心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化和室性心律失常[85]。白藜芦醇还能调节脂质和脂蛋白代谢,可抑制脂质等大分子中过氧化的病理性增加[86];还通过多种机制促进血管舒张,主要是刺激Ca2+激活的K+通道和增强血管内的一氧化氮信号,因此发挥血管松弛活性[87]。同时,葡萄酒中的氨基丁酸是降血压、降血氨的有效成分[88];酯类物质如己酸乙酯、亚油酸乙酯等具有稳定心肺、降血脂的作用[89];益生菌如乳杆菌能够防治高血压、高血糖[78]。

2.4 抗菌消炎

一些具有抗氧化性能的化合物也具有对人体消炎的能力。一些黄酮类化合物可通过抑制一些诱导炎症的转录因子的活性,从而用于治疗过敏性疾病,如槲皮素可平息花生过敏大鼠的过敏反应[90]。许多酚酸如苯甲酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、羟基肉桂酸等也具有抗大肠杆菌、抗芽孢杆菌的活性[91]。Evers等[92]研究发现,白藜芦醇具有抑制人类巨细胞病毒DNA的复制和封闭病毒诱导的细胞信号作用。Wang等[93]研究表明白藜芦醇能削弱奇异变形杆菌侵袭人类膀胱上皮细胞的能力。脯氨酸是葡萄酒中含量最多的氨基酸,其可以参与机体能量代谢并具有机体解毒作用,能消除疲劳和提高机体免疫功能[94]。葡萄酒中含量较高的草酸对猪链球菌、苹果轮纹病菌等均具有抑制作用[95],MLF后大量增加的乳酸对李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌也具有一定的抗菌作用[96]。

3 结语与展望

本文对苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒中的活性成分影响进行综述,发现经过苹果酸-乳酸发酵后葡萄酒中有许多对人体健康有益的成分,如有机酸、益生菌、多酚类物质等,其含量或种类较未经苹果酸-乳酸发酵时有所增加,这说明苹果酸-乳酸发酵不仅能有效降低葡萄酒的酸度,更能使葡萄酒的益生作用增强,对人体健康产生积极影响。因此,在研究利用中国野生葡萄种质资源、酿造优质中国野生葡萄酒等方面可广泛使用苹果酸-乳酸发酵工艺。同时,还有一些葡萄酒中的活性成分如维生素、矿物质等,在苹果酸-乳酸发酵前后的变化没有文献报道,今后可做此方面研究。