脑出血后脑损伤病理机制的研究进展

刘双岭，孔菲，刘刚，孔莹，全爱君

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第二医院针灸科，哈尔滨 150001)

脑出血是指原发性脑实质出血，占急性脑血管病的20%～30%，急性期病死率为30%～40%，在急性脑血管病中病死率最高[1]。2007—2017年，全球范围内脑出血住院人数增加了18%，1990—2010年，全球脑出血的发病率上升了约47%[2]。脑出血后脑损伤是临床治疗的难点，脑神经功能缺损致残率高，严重影响患者身心健康，也对其家庭造成了沉重的精神和经济负担,因此深入研究脑出血后脑损伤的病理机制具有重要意义。目前研究普遍认为，脑出血后脑损伤包括血肿直接压迫和刺激的原发性脑损伤以及血肿周围半暗带区缺血缺氧的继发性脑损伤[3]。脑出血发生后，脑内血流自动调节系统出现继发性的功能障碍，导致大面积神经血管单元缺血缺氧和灰白质结构不可逆的破坏，最终神经元细胞死亡[4]。脑出血发生后脑组织内某些蛋白、酶类的表达水平升高或降低，促进或抑制神经损伤。目前的研究热点集中在脑出血发生后细胞分子信号转导通路对脑损伤的作用，既包括血脑屏障破坏、通透性增强加重的脑水肿及神经损伤[5]，也包括神经炎症、血液中的神经毒性侵袭、细胞凋亡、氧化应激反应等因素对神经损伤的影响[6]。现就脑出血后脑损伤病理机制的研究进展予以综述，为寻找脑出血新的治疗靶点和临床研究提供依据和参考。

1 血脑屏障破坏及脑水肿形成

1.1血脑屏障破坏 血脑屏障是一种由微血管内皮细胞、周皮细胞和星形胶质细胞等组成紧密连接的高度选择性生物屏障，能够阻止某些有害物质由血液进入脑组织。血脑屏障破坏是脑损伤开始的标志，与血脑屏障破坏相关的通路或蛋白有外因子/β联蛋白(β-catenin)通路、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)等。

Wnt蛋白能够诱导细胞增殖及组织生长,Wnt途径中的关键开关是β-catenin[7]。Wnt与受体结合促使β-catenin入核激活靶基因，引发紧密连接蛋白3细胞应答，紧密连接蛋白3是构成血脑屏障的重要成分，因此激活Wnt/β-catenin通路可维持血脑屏障结构完整，有脑保护作用[8-9]。另有研究证实，大鼠脑出血模型中细胞凋亡数量与Wnt/β-catenin通路的表达呈显著正相关，说明Wnt/β-catenin通路不仅影响组织细胞增殖，也调节着细胞凋亡与增殖之间的平衡[10]。这提示可以寻找Wnt/β-catenin通路的调节因子，并以这些调节因子作为新的靶点来设计药物，促进脑组织中紧密连接蛋白3细胞的增殖抑制其凋亡，从而保护血脑屏障。GSK-3β具有促凋亡特征，脑出血后GSK-3β表达增加，GSK-3β可促进下游β-catenin磷酸化，且GSK-3β与β-catenin呈负相关[11]。应用GSK-3β抑制剂锂治疗脑出血大鼠可增加β-catenin活性和紧密连接蛋白1和3的表达，从而减轻血脑屏障损害[12]。这表明，可以设计抑制GSK-3β的药物来增加脑组织中β-catenin以及升高紧密连接蛋白1和3的水平，为脑出血后脑保护的治疗提供新方案。

MMP-9可分解构成血脑屏障的膜周蛋白和胶原等细胞外基质，脑出血后MMP-9表达水平升高，增加了炎症因子聚集并促进白细胞向脑实质扩散，进一步破坏血脑屏障[13]。脑卒中早期黏附于血管内皮的中性粒细胞释放的MMP-9可导致内皮细胞和星形胶质细胞的基底层降解，破坏血脑屏障并加重脑损伤；而脑卒中恢复期内皮细胞、神经元、胶质细胞释放的小剂量MMP-9可重塑基膜并恢复细胞间接触，重建血脑屏障[14]。脑卒中后血脑屏障破坏的治疗窗口非常短，其后的修复功能占主导地位，但目前血脑屏障的功能重塑机制研究并不全面，MMP-9在脑出血急性期及恢复期可能因浓度不同而表现出功能差异，因此其在脑内释放的定量与定性研究仍需深入展开。

1.2脑水肿形成 在脑水肿的研究中，水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)的研究比较广泛[15]。AQP4是中枢神经系统星形胶质细胞表面调节水转运的一种蛋白，是星形胶质细胞表面正常的组成成分。AQP4参与脑内水液代谢并可破坏内皮细胞和紧密连接,因此脑出血后AQP4表达增多可加重脑水肿。Zhong等[16]的实验发现，香芹酚可抑制脑出血大鼠血肿周围AQP4的表达，减弱出血后脑水肿引起的脑损伤，表明AQP4的抑制剂是治疗脑出血后脑水肿的一个研究方向。此外，AQP4还具有抗细胞水肿能力，人参皂苷的抗水肿活性是由AQP4来介导，当AQP4基因沉默表达时引起的星形胶质细胞肿胀不能被人参皂苷减轻[17]。AQP4可能对中枢细胞的水液代谢有双向调节作用，高表达时增强质膜通透性使细胞入水增多，同时也作用于细胞出水，但对其在细胞水运中发挥不同作用的机制仍需进一步研究。另有研究指出，AQP4除脑内水运外，还参与脑内氧气交换和能量代谢，AQP4四聚体的中心孔可渗透氧气，参与脑内氧的扩散[18]。今后可以从AQP4的激活途径、生物化学变化、氧气输送、调节脑内能量代谢等方面继续深入研究，探索减轻神经水肿及脑保护的新原理。

总之，血脑屏障结构与功能的破坏促使脑水肿加重，脑水肿又会导致大脑组织发生水电解质平衡紊乱、能量代谢改变等一系列病理生理变化，进一步破坏血脑屏障。两者均加剧了继发脑损伤，而上述通路或蛋白为寻找脑出血新的治疗靶点提供了参考依据。

2 炎症反应与氧化应激

2.1炎症反应 脑出血后脑组织因炎症刺激释放的酶和致炎因子可加重脑神经损伤，但同时也释放清除炎症的因子，促进细胞功能修复[19]。促炎细胞因子有白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-7、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和Toll样受体-4等[20]；抗炎细胞因子有IL-10、IL-4和转化生长因子-β(tansforming growth factor-β,TGF-β)等[21]。IL-6在急性炎症反应中起促进作用，是早期脑出血临床症状加重的独立因素[22]。TNF-α在脑出血后表达显著增加，并诱导其下游蛋白促进炎症因子表达，TNF-α与脑组织损伤呈正相关[23]。Fu等[24]研究发现，茶黄素能减轻脑出血大鼠炎症细胞因子TNF-α的表达，并可激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路，介导TNF-α、IL-6等促炎细胞因子表达，同时这些促炎细胞因子又进一步活化NF-κB通路，加重脑损伤。IL-10可抑制TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的表达，并通过上调炎症细胞因子拮抗剂表达来发挥抗炎效应[25]。TGF-β是调节细胞生长和分化的因子，可抑制炎症细胞的激活和多种炎症介质的释放，并参与损伤后组织修复。Taylor等[26]证实，脑出血后72 h血清TGF-β1水平升高的患者转归明显改善。

脑出血后炎症反应的变化一直是脑损伤研究的热点问题。促炎和抗炎细胞因子均不是单一存在，脑出血发生后两者一直有此消彼长的动态变化。如何在早期抑制促炎细胞因子及后期促进抗炎细胞因子的释放是今后研究的关键，且多种因子间的协同作用也值得更深入研究，这些研究成果将为治疗脑出血后炎性脑损伤提供新的理论依据。

2.2氧化应激 氧化应激是指体内氧化和抗氧化作用失衡的一种状态。氧化应激发生时所产生的大量活性氧类会损坏血脑屏障、介导髓鞘脱失和轴索损伤，并且能激活多种信号通路诱发加重自身免疫炎症和神经细胞凋亡。目前，对超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等的研究较多见。SOD水平与自由基含量呈负相关，SOD水平越高机体清除自由基的能力越强。丙二醛是自由基产生的脂质过氧化产物，反映了氧化损伤程度，SOD活性与丙二醛含量常联合检测[27]。Wang等[28]将脂联素基因注入脑出血模型大鼠，24 h后检测显示SOD增加，丙二醛减少，说明脂联素过表达可抑制中枢系统氧化应激，减轻脑损伤。GSH-PX能反映机体抗氧化水平，催化还原性谷胱甘肽氧化。研究者往往采用多角度的方法，将GSH-PX结合其他指标联合检测，以得到更为严谨、精准的预期结果[29]。MAPK作用于氧化应激的启动与识别，与脑损伤呈正相关，使用MAPK相关蛋白阻断剂可起到脑保护作用，且联合阻断剂效果更佳[30]。这提示，多重阻断氧化应激反应相关信号通路是减少脑损伤的研究思路之一。此外，脑出血发生后活性氧自由基生成和清除的平衡失调，大量自由基可以通过损伤DNA、影响信号转导以及参与基因表达调控等途径加重神经损伤，因此未来研究方向可以从抑制氧化或增加抗氧化双重角度出发，寻找治疗脑出血后脑损伤的药物。

脑出血后的炎症反应与氧化应激关系密切，炎症通过氧化应激造成脑损伤，而氧化应激刺激下又促使炎症进一步发展，加重了神经血管损伤和神经功能缺损[31]。未来可以将炎症与氧化应激反应中相互作用的蛋白通路作为靶点筛选药物，为寻找减轻脑损伤的有效治疗方案提供研究依据。

3 自噬与细胞凋亡

3.1自噬 自噬是一种通过溶酶体降解途径实现真核细胞回收的过程。脑出血后脑损伤可启动机体保护机制，导致自噬现象显著增强[32]。有关自噬的蛋白研究主要涉及蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like extracellular regulated kinase,PERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)和自噬的启动基因Beclin-1等。PERK通路高度参与细胞的自噬活动，激活PERK途径可减少蛋白质合成，促进细胞碎片降解，减少细胞凋亡，促进神经元存活[33]。 PI3K/Akt/mTOR信号转导通路具有抑制神经细胞自噬与凋亡作用[34]。脑组织再灌注损伤时可将PI3K 激活，活化下游效应分子Akt，下传信号到mTOR，活化的mTOR可抑制细胞自噬、凋亡[35]。脑出血后细胞过度自噬可导致脑损伤，自噬的启动基因Beclin-1起到促进自噬体形成的作用。硫化氢预处理抑制了脑出血后自噬标志物Beclin-1的活化，提示Beclin-1的抑制剂可能在脑出血后脑损伤治疗中具有潜在的应用价值[36]。

3.2凋亡 脑出血后凋亡相关调控的研究开展较早，实验研究中多涉及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)和NF-κB等蛋白通路。其中Bcl-2抗凋亡，Bax促凋亡，caspase-3是细胞凋亡最终效应因子，Bax表达增加抑制Bcl-2作用。正常脑组织内Bcl-2与Bax表达含量相当，但脑出血发生后两者比例失调，如何将过表达的Bax含量降低并提高被抑制的Bcl-2表达是脑保护的重要问题。Ma等[37]研究重组活化凝血因子Ⅶ对脑出血大鼠脑损伤的治疗作用发现，实验组Bcl-2高表达，Bax低表达，证实重组活化凝血因子Ⅶ通过促进Bcl-2和抑制Bax表达对脑出血后损伤神经元发挥保护作用。这表明可以筛选抑制促凋亡因子及增强抗凋亡因子的药物来进行研究，并关注两者的动态变化规律，寻找药物协同作用的靶点。

NF-κB信号转导通路可调节Bax和Bcl-2的表达变化，具有抗凋亡和促凋亡的双重特性。NF-κB能上调抗凋亡基因及促凋亡基因：Bcl-2上有NF-κB结合位点，NF-κB活化后，线粒体膜上的Bcl-2基因表达增加，线粒体膜的通透性降低，抑制了线粒体凋亡途径；细胞缺血缺氧时，激活NF-κB上调了促凋亡基因Bax表达，引起凋亡[38]。目前，对于NF-κB在脑血管病急性期及恢复期促凋亡或抗凋亡作用的机制研究尚不够深入，因此可以进一步完善NF-κB神经细胞凋亡动态变化的双向调节作用研究，设计一些脑出血后不同时间点阻断或促进NF-κB通路表达的药物实验，来寻找减轻脑出血后脑损伤的新治疗方案。自噬与凋亡互相影响，自噬可以诱发凋亡，凋亡又可以激活自噬通路。两者在脑出血后脑损伤的病理发展进程中联系紧密、互为因果。未来可以从减少神经细胞过度自噬及抑制凋亡的共同影响因子等角度进行深入研究，筛选脑出血后脑保护的治疗药物。

4 铁过载

脑内血肿是影响患者生存率和生存质量的重要因素，在血肿周围超负荷的铁可以加速神经炎症，加剧神经元丢失，加重脑继发性损伤。脑出血后不久，中性粒细胞一方面释放出破坏性分子增强脑损伤；另一方面也释放有益分子，包括清除铁的乳铁蛋白来减轻铁介导的脑损伤[39]。铁螯合剂米诺环素可显著降低血肿周围区域的铁过载，并进一步减少了脑肿胀、神经炎症、神经元丢失、延迟性脑萎缩和神经功能缺损等[40-41]。Liu等[42]发现，脑出血后脑皮质、基底节神经元和星形胶质细胞均可以表达铜蓝蛋白，它能将有毒的亚铁(Fe2+)氧化为毒性较小的三价铁(Fe3+)，说明通过强氧化剂改变价态也可以达到减弱亚铁毒性目的，这是脑出血后铁过载治疗的一个新思路。

5 小胶质细胞

小胶质细胞占脑内所有细胞总数的5%～10%，是脑组织内特有的固有免疫细胞。小胶质细胞的活化状态与脑内受损部位的严重程度密切相关，脑出血后小胶质细胞活化可体现有害与有益双重作用，表现为破坏性M1表型和保护性M2表型[43]。脑出血发生后，小胶质细胞开始活化，进而分泌促进中性粒细胞和单核细胞浸润的细胞因子和趋化因子[44]。脑出血前期出现M1型小胶质细胞可释放促炎细胞因子和自由基，损害大脑的修复与再生，后期转变为M2型小胶质细胞，通过增强吞噬作用减少脑部炎症，促进大脑的修复与再生[45]。Schreibman等[46]研究了有关等渗甘露醇作用于脑出血大鼠模型的靶点,证实小胶质细胞活化在用药后减少，为定期重复使用渗透治疗药物可减少脑出血后神经炎症提供了依据。另有研究发现，穿心莲内酯可抑制NF-κB信号通路激活并影响小胶质细胞的凋亡，体内TNF-α和IL-6的水平均明显降低，表明穿心莲内酯可减轻脑出血后继发脑损伤[47]。今后可以设计抑制脑出血早期脑内激活小胶质细胞的药理实验，筛选减轻脑出血后脑损伤的新药物及方法。活化的小胶质细胞参与了炎症反应与免疫应答机制，加速神经细胞凋亡。脑出血后小胶质细胞发挥不同作用的机制值得深入研究，有待解决的问题是如何更快地促使脑损伤后小胶质细胞从M1型转向M2型。

6 其 他

脑出血后脑损伤的病理机制还涉及谷氨酸毒性、凝血酶系统、长链非编码RNA失调、蛋白质组学和脑内能量代谢变化等方面。脑出血后兴奋性毒性的谷氨酸表达过量，可影响脑出血后脑损伤[48]。脑出血后凝血酶系统被激活，凝血酶原信使RNA表达上调，局部凝血酶表达驱动了神经元损伤[49]。

长链非编码RNA主要参与转录激活等细胞多种调控过程。微阵列描述实验性脑出血后期的长链非编码RNA图谱可发现，脑出血后遗症可能涉及线粒体基质、G蛋白偶联受体活性降低以及嗅觉传导受损等[50]。这些失调的长链非编码RNA和信使RNA可能是脑出血后脑损伤治疗的新靶标。神经蛋白质组学方法可以鉴定脑卒中后脑损伤病理生理过程中产生的候选生物标志物，现已证明出血性脑卒中蛋白与自噬、局部缺血、坏死、细胞凋亡、钙蛋白酶激活和细胞因子分泌有关[51]。蛋白质组学可以精准筛选靶蛋白关键信息，Liu等[52]对脑出血中的蛋白质变化进行了综合评估，并研究了脑出血后的能量代谢，首次发现氮代谢途径在脑代谢中的核心位置，并初步探索脑出血能量代谢构建的蛋白质网络。这提示脑损伤从分子通路水平到组织代谢水平均应给予足够重视，由蛋白质组学和能量代谢角度观察脑出血后脑损伤病理变化将是未来的研究方向。

7 小 结

脑出血后继发性脑损伤的病理途径包括血脑屏障的破坏及脑水肿形成，氧化应激和炎症反应、自噬与细胞凋亡、小胶质细胞活化、脑内能量代谢及蛋白质组学改变、兴奋性毒性、铁沉积等[53]。这些病理途径相互作用，单一论证脑出血后脑损伤病机是不充分的。Wang等[6]研究表明，褪黑素可通过影响细胞凋亡、炎症、氧化应激、DNA损伤、脑水肿和血脑屏障损伤来改善脑出血引起的继发性脑损伤症状。Qi等[54]研究发现，二甲双胍可下调凋亡因子caspase-3以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，证实二甲双胍可成为临床治疗脑出血的潜在药物。未来对脑出血后脑损伤的研究可从同一靶点的不同角度展开，如MMP-9在脑出血急性期及恢复期释放浓度不同因而功能不同；AQP4可能对中枢细胞的水液代谢具有双向调节作用；NF-κB通路在促凋亡或抗凋亡作用中的动态变化；脑出血后小胶质细胞发挥不同作用对脑损伤影响等。多角度研究还包括体内脑出血动物模型及体外细胞培养、引入基因敲除的实验模型、增加激动剂与抑制剂等，并采用多重分组论证药物及疗法的作用靶标。相信未来对脑出血后脑损伤的研究会有更多的新角度与方法，并且这些研究成果会有效服务于临床。