Chk1激酶在恶性血液肿瘤中的研究进展

刘继敏，文飞球，2

(1.遵义医科大学珠海校区，广东 珠海 519041； 2.深圳市儿童医院血液肿瘤科，广东 深圳 518000)

血液肿瘤是一类造血系统恶性增殖性疾病，近年来发病率呈全球性增长的趋势[1]。血液肿瘤主要包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，随着治疗技术的不断改进，部分淋巴瘤和白血病的疗效虽有了很大程度的提高，但仍有部分患者易耐药、易复发，病情可急剧恶化，导致预后较差、病死率较高。因此，寻求新的分子靶点、开发出新的治疗方案、提高治疗效果是当前急需解决的问题。近年来，细胞周期检查点激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)在血液系统肿瘤发病中的作用引起人们的关注，其最初被认为是一种肿瘤抑制因子，但随着研究的深入发现，Chk1可促进肿瘤生长[2]。Chk1在多种人类肿瘤如乳腺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、血液肿瘤等中过表达，其过表达也与部分血液肿瘤的耐药、复发及不良预后密切相关[3]。正常细胞存在完整的G1期和S/G2期细胞周期检查点，DNA损伤因子的刺激可产生复制应激，通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ataxia telangiectasia mutated kinase，ATM)/p53途径激活G1期和S/G2期检查点，抑制复制应激，修复DNA损伤，促进细胞的生存。然而，包括部分血液肿瘤在内的肿瘤细胞往往缺乏ATM/p53信号，导致G1期检查点调控缺陷，通过依赖共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase，ATR)/Chk1途径激活S/G2期检查点以修复DNA损伤[4]。遗传学研究证实，Chk1的失活或抑制会破坏由DNA损伤引发的细胞周期阻滞，且Chk1抑制剂可促进部分肿瘤细胞死亡[5]。现就Chk1的生物学特点、与血液肿瘤的关系及Chk1抑制剂在血液系统肿瘤中的应用进行综述。

1 Chk1概述

Walworth等[6]在寻找与细胞周期调节激酶p34cdc2相互作用的成分时发现了一种新型裂殖酵母蛋白激酶同源物，并将编码该蛋白的基因命名为Chk1。Chk1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量约为54 000，人类Chk1基因位于染色体11q24，由476个氨基酸组成，在进化上高度保守[7]。Chk1由N端的激酶结构域、C端的抑制性结构域、中间的可变连接域以及丝氨酸-谷氨酰胺/苏氨酸-谷氨酰胺调节域四部分组成，其中N端是催化底物磷酸化的激酶区域，C端是接受磷酸化调节的丝氨酸/谷氨酰胺区[7]。

有研究表明，Chk1在调节细胞周期、参与DNA损伤修复中发挥着关键作用，并可影响细胞的存活和凋亡，参与胚胎的生长发育等[8]。在正常细胞周期中，Chk1调节S期DNA的复制、G2/M期和M期的进入以及M期纺锤体和染色体的组装，并可调节细胞对氧暴露、蛋白质异常折叠以及人类免疫缺陷病毒感染的应激等[2，9-10]。此外，Schuler等[11]研究发现，Chk1对维持造血系统功能也有重要作用，但在早期造血干细胞动力学以及成熟血细胞稳态中的作用仍需进一步探索。

1.1Chk1与细胞周期调控 细胞周期的连续性和DNA复制的保真性对基因组的稳定性以及肿瘤抑制至关重要。正常情况下，为保证有丝分裂的顺利启动和细胞周期的完整性，细胞周期受周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)等调控蛋白和检查点机制的严格调控。在哺乳动物细胞中存在G1/S期、S期、G2/M期以及有丝分裂检查点，当DNA损伤时，细胞通过Chk1和Chk2启动细胞周期阻滞，其中Chk1使细胞周期停滞在S期或G2期，阻止DNA受损的细胞进入有丝分裂；而Chk2使细胞周期停滞在G1期，以确保细胞正常进入下一个阶段[12]，为DNA损伤修复争取时间，提高细胞存活率，或通过凋亡途径促进细胞死亡。

1.2Chk1与DNA损伤应答(DNA damage response，DDR) 人类基因组DNA受多种因素影响，包括内部因素和外部因素。这些因素共同作用可能导致遗传信息发生不同程度的改变，如DNA突变、DNA单链断裂、DNA双链断裂等。为防止突变基因传递给下一代，人体衍生出一套复杂且高度协调的信号转导通路网络，称为DDR[13]，其可避免细胞受到DNA的持续损害。正常细胞有完整的检查点信号通路，DNA损伤后细胞的存活依赖于检查点的激活并启动DNA损伤修复系统。DDR有两条重要的信号通路：一条是ATM-Chk2-细胞分裂周期蛋白25(cell division cyclin 25，CDC25)信号通路，当DNA发生双链断裂时，该信号通路被激活；另一条信号通路是ATR-Chk1-CDC25信号通路，当DNA发生单链断裂时被激活，启动DNA损伤修复系统，上游ATR将DNA受损信号通过中介因子传递至Chk1，Chk1定位聚集在DNA损伤位点，并被ATR Ser317/345两个位点磷酸化激活，然后Chk1磷酸化抑制其下游的CDK激活物CDC25A，使CDC25A加速泛素化并降解，从而抑制CDK的激活，促使细胞周期阻滞于S/G2期或G2/M期[14-15]。同时，Chk1磷酸化激活CDK的拮抗剂Wee1，导致G2期延迟，为DNA损伤修复创造条件；若受损严重难以修复，则诱导细胞凋亡防止恶变，促进复制叉的稳定和重新启动，从而维持基因组的稳定性[14-15]。

2 Chk1与血液肿瘤

Chk1在多种人类肿瘤中均显示出过表达的现象。对转基因小鼠的研究发现，高水平Chk1通过抑制复制应激促进癌基因诱导的致癌转化[16]。Chk1对癌细胞的增殖与生存均有重要作用[17]，与Chk1低表达肿瘤细胞相比，Chk1高表达肿瘤细胞更能耐受放疗、化疗或其他肿瘤治疗方法(如组蛋白去乙酰化酶抑制剂)引起的DNA损伤反应，促进产生恶性程度更高的肿瘤细胞，并可导致耐药现象的发生及肿瘤的频繁复发[18]。以上研究提示，Chk1在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

2.1Chk1与白血病 急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)按照免疫表型分为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)。T-ALL是一种由T细胞前体克隆扩增引起的恶性血液肿瘤，由于大量基因损伤，导致细胞CDK过度激活和S期进展失调，进而导致DNA复制受损，使T-ALL细胞趋向于高度增殖。基因组的稳定性直接关系到细胞的癌变，其中DNA复制是最易发生变化的过程，也是最易致癌的过程。任何导致DNA高水平损伤的发生条件都会引发复制应激，这是基因组不稳定的来源之一，也是癌变前细胞和癌变细胞的一大标志。Sarmento和Barata[19]发现，Chk1在T-ALL中存在过度表达和过度激活，认为其与高水平的复制应激有关。该研究采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法发现，实验组Chk1信使RNA转录水平和蛋白质表达水平均明显高于正常对照组，且Chk1信使RNA转录水平在不同T-ALL亚组之间也存在差异，增殖组和TAL-LMO亚群的表达显著高于TLX和ETP-ALL亚群组；Chk1抑制剂可促进T-ALL细胞死亡，呈剂量和时间依赖性方式抑制T-ALL细胞增殖，并可显著延迟T-ALL白血病动物肿瘤的生长[17]。该研究认为，Chk1通过下调复制应激和阻止ATM/胱天蛋白酶3依赖的细胞死亡在T-ALL白血病细胞的增殖和生存中发挥关键作用[17]。抑制Chk1会导致G2/M期检查点缺失，使DNA复制不完全的T-ALL细胞异常进入有丝分裂，引发有丝分裂灾难，导致细胞死亡[12]。此外，Chk1对控制复制应激的积累和防止T-ALL细胞凋亡也有重要作用[19]。

AML是一种难治愈且易复发的高风险血液系统肿瘤。研究证实，AML患者的细胞中存在Chk1的高表达[20]。阿糖胞苷是AML一线治疗诱导和补救方案的基础，在初发AML中，基于阿糖胞苷的方案可使高达80%的患者完全缓解，但超过50%的患者最终会复发，且在完全缓解率相同的条件下，Chk1高表达的细胞复发率较高，提示Chk1的表达水平与微小残留和疾病复发持续存在相关性[3，21]。另有研究表明，在复发的AML患者中，阿糖胞苷可诱导突变率增加[22]。高水平的Chk1可通过增强复制叉的稳定使其重新启动，从而保护AML细胞免受阿糖胞苷的毒性作用[23]，提示Chk1的表达水平可能与耐药相关。David等[3]对198例AML患者进行多因素分析发现，Chk1高表达与使用阿糖胞苷和蒽环类药物治疗AML患者复发率增加和总生存期较短相关，高表达和低表达Chk1患者预测5年总生存期分别为29.5%和52.4%，因此认为Chk1高表达与不良预后相关。此外，CPX-351是美国食品药品管理局批准用于治疗相关性AML和伴有骨髓异常增生改变的AML的一种化疗药物，其总体生存率高于标准阿糖胞苷/蒽环类药物化疗[24]。有研究发现，敲除或抑制Chk1可增强CPX-351诱导的多个AML细胞系的凋亡，并增加了CPX-351在体外对原发性AML细胞的抗增殖作用[25]。Yuan等[26]研究发现，抑制Chk1基因的表达可降低FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复阳性AML细胞的增殖。

2.2Chk1与淋巴瘤 淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，往往过表达MYC，MYC驱动的复制应激可导致DNA损伤，影响基因组的稳定性[27]。抑制Chk1可诱导DLBCL细胞系和DLBCL原代细胞中DNA的快速积累，阻止增殖，并促进细胞凋亡[28]。研究发现，Burkitt淋巴瘤中MYC信使RNA的表达与Chk1表达显著相关，且Chk1的表达受MYC和细胞周期转录因子E2F癌基因控制[16]。采用免疫组织化学法分析多种淋巴瘤亚型中Chk1的表达水平发现，与其他B细胞淋巴瘤亚型相比，Burkitt淋巴瘤患者Chk1的表达水平明显更高[29]。在小鼠淋巴瘤中，有效抑制Chk1能够显著延缓疾病进展，提示Chk1表达的失调可能与淋巴瘤预后有关[8]。

3 Chk1抑制剂在血液系统肿瘤治疗中的应用

当Chk1被抑制时癌细胞会失去对DNA损伤的反应和修复能力，从而增强化疗或放疗对细胞的杀伤力。Chk1抑制剂与化疗或放疗相结合可能在癌症的治疗中发挥着化放疗增敏的作用[13]。白血病和淋巴瘤细胞易受Chk1损耗的影响，已有研究证明了Chk1抑制剂作为治疗B/T-ALL和淋巴瘤新策略的有效性[5，30]。迄今为止，已有多种Chk1抑制剂作为增敏剂用于包括血液肿瘤在内的多种肿瘤的治疗。临床前期和早期临床研究显示，部分Chk1抑制剂具有单药活性，与抗代谢药或靶向制剂联合使用能有效抑制Chk1，发挥抗肿瘤作用[28，31]。目前，与血液肿瘤研究相关的Chk1抑制剂有UCN-01、AZD7762、MK-8776、PF-00477736、LY2606368。

UCN-01是第1代Chk1抑制剂，为Chk1/2双重抑制剂，可增强电离辐射和抗癌药物对包括血液肿瘤在内的多种肿瘤细胞系的毒性。但由于该化合物不稳定的药动学特性和较多的不良反应，临床试验尚未取得进展[32]。AZD7762是一种强效的Chk1/2双重抑制剂，其功能主要依赖于对Chk1的抑制，联合化疗药物可阻止肿瘤生长，特别是p53突变或缺失的肿瘤[33]。有研究指出，p53可能不是Chk1抑制剂疗效唯一的决定因素[34]。Restelli等[35]研究证实，AZD7762与ATR抑制剂组合在淋巴瘤细胞系(DLBCL和套细胞淋巴瘤)中有较强的协同作用，但因其心脏毒性和多重不良反应而终止临床试验。

MK-8776 (即SCH 900776)是一种高效选择性Chk1抑制剂。研究发现，该药物可增加DNA抗代谢物羟基脲、吉西他滨对肿瘤细胞的毒性作用，在体内外均表现出化学敏感性，且对正常组织无影响[36]。Ⅰ期试验表明，MK-8776与Ara-C联用的耐受性和疗效均较好[37]，两者联合治疗难治性急性白血病正在行Ⅱ期临床试验。此外，Suzuki等[38]研究证明，在最低毒性浓度下，MK-8776具有很强的辐射增敏作用，但目前尚未见该作用在血液肿瘤中应用的报道。

PF-00477736是一种高效选择性ATR竞争性Chk1抑制剂，在体内可增强紫杉烷类的抗肿瘤活性[18]。有研究显示，PF-00477736对原发性T-ALL具有细胞毒性作用，可显著延迟小鼠异种移植T-ALL肿瘤在体内的生长，单药治疗耐受性良好[17，39]。Derenzini等[28]证实，在DLBCL原代细胞中，随着磷酸化Chk1的增加，PF-00477736可诱导DNA损伤积累，对侵袭性淋巴瘤细胞有选择性细胞毒性作用，且不会诱导正常骨髓单核细胞发生特异性变化。另有研究表明，套细胞淋巴瘤细胞对PF-00477736单药非常敏感，效果明显强于其他B细胞淋巴瘤细胞系和上皮癌细胞系，联用PF-00477736和Wee1抑制剂MK-1775可观察到较强的协同作用[40]。布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂依鲁替尼已被批准用于难治性套细胞淋巴瘤的治疗，但仍有部分患者会出现耐药。一项临床前研究提示，PF-00477736与依鲁替尼联合用于套细胞淋巴瘤细胞系具有协同效应，极低浓度的PF-00477736便能增加依鲁替尼的活性[41]。

LY2606368 (Prexasertib)是一种Chk1/2双重抑制剂，在体外可优先选择性结合并抑制Chk1[42]。有研究发现，LY2606368单药治疗显示出良好的抗肿瘤效果，不仅增强了顺铂敏感肿瘤的疗效，还能够提高顺铂耐药肿瘤的疗效[43]。Ghelli Luserna Di Rorà等[39]研究发现，LY2606368单药治疗可降低白血病细胞活力，并具有剂量和时间依赖性，与伊马替尼联合使用对降低细胞活力具有协同叠加效应，但在正常细胞中并不会显著降低细胞活力。此外，该药物对鳞状细胞癌具有一定的治疗作用，目前处于Ⅱ期临床试验阶段[44]。

新的Chk1抑制剂如CCT245737、GDC-0575、V158411、SRA737等仍在临床前开发中，能不同程度的增强化疗药物或其他靶向制剂的作用[45-48]，期待其能更好地应用于临床。

4 小 结

Chk1在DDR及细胞周期调控中具有重要作用，与部分血液肿瘤的发生发展、复发、耐药及预后相关，可能是一个潜在的抗肿瘤治疗靶点。临床前期研究证实Chk1抑制剂治疗血液恶性疾病有一定效果，但是否能仅通过调控Chk1抑制肿瘤的发生和进展尚不清楚。虽然Chk1抑制剂在化疗增敏方面的前景看好，但部分抑制剂存在脱靶效应，且安全性也尚未得到证实[49]。此外，Chk1抑制剂与其他靶向S/G2期检查点的抑制剂组合能否在抗癌治疗中获得满意疗效，还需要进一步探究。深入了解Chk1在血液肿瘤中的作用，发现新的预测生物标志物用于识别可能对不同类型Chk1抑制剂敏感或耐药的患者，将有望提高恶性血液肿瘤的治疗效益，为肿瘤患者带来更好的生存预后。